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Theriogenology, 47(1): 194 (1997)
NEOMYCIN DISTURBS BOVINE OOCYTE MATURATION AND DELAYS EMBRYO DEVELOPMENT IN VITRO.

C.C. Marques, R.M. Pereira, M.C. Baptista, M.I. Vasques and A.E.M. Horta
Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional, INIA,
2000 Vale de Santarém, Portugal


The effects of two different associations of antibiotics added to the culture media (TCM199 + 10% of oestrous cow serum-OCS) of an in vitro system for bovine oocyte maturation and embryo production (Group I: 100 UI/ml of penicilin + 100 ug/ml of streptomycin; Group II: the same as before plus 200 ug/ml of neomycin) were studied. Oocyte maturation (after 24 h of culture) was checked by morphological examination on 1029 (Group I) and 999 (Group II) cultured oocytes, and by nuclear staining with lacmoid (n=148 and n=113 for Groups I and II, respectively). Nuclear stages were assessed matured or non-matured (Suss et al., 1988, Biol Reprod, 38: 871-880). Neomycin caused a significant reduction on oocyte maturation (Table 1).

Table 1. Effect of neomycin on oocyte maturation checked by morphological evaluation and nuclear staining.
Morph. evaluationNuclear staining
MaturedNon-maturedMaturedNon-matured
n%%n%%
Without Neomycin102975 a2514886 a14
With Neomycin99962 b3811372 b28
Signif. (chi 2) p < 0.0001 p < 0.003

Oocytes morphologically scored as matured (n=771 and n=622 for groups I and II, respectively) were submitted to in vitro fertilization. For subsequent development after IVF the embryos were co-cultured on granulosa cell monolayers. Cleavage rate (CR) assessed at 48 h post-IVF, day 8 blastocysts (Bl) and day 13 hatched blastocysts (HB) were not significantly different between groups (CR: 64.2 vs 61.1%; Bl: 16.6 vs 13.4% and 68.3 vs 74.5%, for groups I and II respectively; P > 0.05). Different embryonic stages (morula, young blastocysts, blastocysts, expanded and hatched blastocysts) evaluated from days 7 to 10 of culture were found between groups. At D7, the proportion of young blastocysts was 30% higher in group II (44.1 vs 74.4%; P < 0.008) and that of Bl was 23% higher in group I (38.2 vs 15.4%, P< 0.027). Embryo grading at day 8 was similar between groups (P > 0.05). At D9, the proportion of Bl in group II doubled that of group I (21.7 vs 10.1%, respectively; P< 0.045) and that of HB was twofold higher in group I (33.3 vs 16.7%, P< 0.022). At D10, a significantly higher proportion of retarded embryos was found in group II (Blastocysts: 1.8 vs. 11.4%; P< 0.043).
These results suggest that neomycin, when added in association with penicilin and streptomycin to culture media, adversely affects in vitro oocyte maturation and retards embryo development.

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Anim. Reprod. Sci., 46: 55-67(1997)
INFLUENCE OF AN ANTIPROGESTIN (ONAPRISTONE) ON IN VIVO AND IN VITRO FERTILIZATION

S. Cavaco Gonçalves1, C.C. Marques1, K. Stöckemann2, W. Wang3, A.E.M. Horta1
1 Dpt. de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional, INIA, 2000 Vale de Santarém, Portugal
2 Research Laboratories of Schering AG, Berlin, Germany
3 Animal Reproduction Laboratory, Guangxi Agricultural University, Nanning, P's R. China


The effects of a progesterone antagonist (onapristone) on heat synchronization, LH surge, ovulation, oocyte maturation and fertilization of superovulated ewes were studied. Its effects on in vitro bovine oocyte maturation and fertilization were also studied. Estrus synchronization and superovulation treatments were applied to 39 adult ewes using an intravaginal sponge with fluorgestone acetate for 9 days with injections of prostaglandin F2alpha and PMSG given 24 h before sponge withdrawal. The animals were randomly assigned to four different groups; T1 receiving only the synchrony treatment (n=11); T2 ewes received two injections of onapristone (1 mg kg-1, i.v.) 12 h apart from 3 h after sponge withdrawal (n=10); T3 ewes received two injections of progesterone 12 h apart from sponge withdrawal (n=10); and, T4 ewes received both onapristone and progesterone as described (n=8). Ewes were mated by a fertile male during estrus. Progesterone and LH were measured during the superovulation period in plasma samples taken every 4 h. Uterine flushings for ova recovery were performed at 5 days (n=25), 48 h (n=5) and 24 h (n=5). Non-fertilized oocytes collected at 24 and 48 h were checked for meiosis resumption. The effects of two doses of onapristone (D1 and D2) on in vitro bovine oocyte maturation (control=100, D1=100 and D2=100) and fertilization (control=107, D1=40 and D2=75) were also studied.
The percentage of animals showing heat signs was significantly lower in group T3 (50% vs 100%). The onset of oestrus (27.6, 24.8, 68.8 and 25.5 h, respectively for T1, T2, T3 and T4) and an LH surge (32.3, 28.8, 76.5 and 30.5 h, respectively for T1, T2, T3 and T4) after sponge withdrawal were significantly delayed in group T3. There were no significant differences in the intervals between estrus and LH surge among groups (4.61 ± 0.75 h). The response and ovulation rates until 40 h after sponge withdrawal (group T3 excluded) were similar among groups, but the fertilization rates were significantly lower in groups T2 and T4 when compared with T1 (2% and 3% vs. 41%, respectively; P < 0.001) due to sperm arrest in the cervix. Ova recovery rate decreased significantly from 24-48 h to 5 days and was not affected by treatments (76.9% vs. 37.1% respectively). Onapristone did not affect the resumption of meiosis. Fertilization of bovine oocytes in vitro decreased significantly only in group D2 when compared to control (48% vs. 62.6%, respectively). In conclusion, onapristone treatment during the preovulatory period did not interfere with normal synchronization of estrus, ovulation and oocyte maturation but severely compromised fertilization by arresting spermatozoa in the cervix.
Keywords: Ovine; Superovulation; Fertilization; Oocyte maturation; Gonadotropin; Progesterone antagonists; Onapristone; ZK98299.

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7as Jornadas Internacionales de Reproducción Animal, AERA, Murcia, p. 213 (1994)
INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM VACAS DE RAÇA BRAVA

Horta, A.E.M., Chagas e Silva, J.N.*, Cannas Simões, J.P.*, Vasques, M.I.
Dpto. de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional-INIA,
Vale de Santarém, 2000 Santarém, Portugal
* Divisão de Selecção e Reprodução Animal,
Rua Elias Garcia, nº 38, 2700 Amadora, Portugal


Trinta e nove vacas de raça Brava foram submetidas a inseminação artificial (IA) com sémen fresco diluído de touro da mesma raça (9 anos de idade) que se encontrava incapacitado para a monta natural devido a uma luxação sacro-ilíaca. Numa primeira sessão de recolha seminal por electroejaculação a congelação/descongelação afectou significativamente a motilidade dos Spz, determinando a necessidade de efectuar uma segunda sessão de recolha para utilização de sémen fresco diluído (diluição 1:1 em meio diluidor constituído por Triladyl® (Minitub) + água bidestilada + gema de ovo). As 39 vacas foram submetidas a um tratamento de sincronização do ciclo éstrico de forma a fazer coincidir a data esperada dos cios com a recolha do sémen, consistindo na inoculação auricular sub-cutânea de um implante de Norgestomet (3 mg, Crestar® Intervet), extraído 8 dias depois. No dia da implantação, todas as vacas receberam uma injecção i.m. contendo 5 mg de valerato de estradiol associado a 3 mg de Norgestomet. No dia da remoção dos implantes todas as vacas receberam 500 U.I. de PMSG (Cronogest® Intervet) e 25 mg de PGF2alfa, ambos por via i.m.. As IA's (uma por cada vaca) iniciaram-se 48 horas após a remoção dos implantes, com sémen fresco colhido cerca de 1 hora antes do início das IA's (27 500 000 de Spz dotados de movimentos progressivos por dose). Foram colhidas amostras de sangue de cada vaca no dia da IA e 21 dias depois, para doseamento de progesterona (P4). Os sinais utilizados para detectar o efeito do tratamento de sincronização basearam-se na detecção de implantes perdidos, detecção dos cios, emissão de presença de muco (na IA), palpação das estruturas ováricas (na IA) e concentrações de progesterona (na IA). Não foi utilizada qualquer terapêutica sedativa em nenhuma das operações de manipulação dos animais.
Quatro vacas perderam os implantes durante o tratamento (10,3%). Até às 48 horas após o tratamento de sincronização somente 14 vacas (35,9%) apresentaram sinais de cio (aceitação de monta) mas, em 35 vacas (89,7%) foram observados quer o cio, quer a emissão de muco cristalino durante a IA. Com base na palpação dos ovários, só foi detectada uma vaca com sinais de ovulações anteriores pela presença de um corpo lúteo inactivo, revelando-se o método de sincronização 100% eficaz na indução da actividade ovárica nas restantes 36 fêmeas palpadas. O doseamento de P4 no momento da IA revelou níveis altos da hormona (> 1 ng/ml) em 4 vacas 10,3%). Aos 21 dias pós-IA, 33 vacas (84,6%) apresentaram concentrações de P4 superiores a 1 ng/ml, das quais 3 apresentaram igualmente níveis elevados no momento da IA. Aos 60 dias após a IA, 20 vacas encontravam-se gestantes (51,3%). De 4 vacas com progesterona elevada no dia da IA, a gestação foi confirmada em duas delas.
Pelos resultados apresentados podemos concluir que de 39 vacas inseminadas, 30 (76,9%) preencheram todos os critérios compatíveis com uma gestação (P4 <1 ng/ml na IA, P4> 1 ng/ml aos 21 dias, com um folículo palpável na IA e com cio ou muco hialino), 3 (7,7%) apresentaram valores de P4 > 1 ng/ml na IA, e P4 > 1 ng/ml aos 21 dias, com muco e folículo na IA, 2 das quais presentaram cio e foram confirmadas gestantes e 6 (15,4%) definitivamente não gestantes (P4 < 1 ng/ml aos 21 dias). O diagnóstico de gestação por palpação transrectal revelou que 51,3% dos animais estavam gestantes aos 60 dias, indicando uma taxa de mortalidade embrionária de 30% para esta raça nas condições estudadas.
Estes resultados, muito semelhantes a outros já obtidos em Espanha (Acosta Rodrigues et al., 1992, VI Jornadas Internacionales de Reproducción Animal e Inseminación Artificial, Salamanca, pp. 157-162), permitem confirmar a viabilidade da inseminação artificial com sémen fresco diluído em vacas da raça Brava sincronizadas, cuja suspeição foi indiciada anteriormente em Portugal (Nunes Duarte e Cannas Simões, 1986, III Simposium Internacional de Reprodução Animal, Lisboa, pp. 183-188).

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Revista Portuguesa de Zootecnia, 2(2): 103-110 (1995)
INFLUÊNCIA DO SÉMEN DE DIFERENTES TOUROS SOBRE AS TAXAS DE FERTILIZAÇÃO IN VITRO E DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES EM CO-CULTURA

C.C. Marques, M.C. Baptista, R.M. Pereira, M.I. Vasques, L.F. Lopes da Costa1, A.E.M. Horta.
Estação Zootécnica Nacional, Vale de Santarém - 2000 Santarém.
1 Faculdade de Medicina Veterinária, Lisboa.


São apresentados os resultados relativos às taxas de fertilização in vitro (FIV) e desenvolvimento de embriões em co-cultura com células da granulosa em monocamada. Foi estudado o efeito do sémen de 5 touros diferentes sobre aqueles parâmetros. Durante o ano de 1994, realizaram-se 63 sessões a partir de uma população de 15544 oocitos aspirados de 2326 ovários bovinos colhidos em matadouro. Em cada sessão de fertilização utilizaram-se pelo menos dois dos touros estudados, tendo-se inseminado 10563 oocitos maturados (a partir de 12063 oocitos colocados em cultura). O sémen utilizado na fertilização in vitro foi previamente tratado pela técnica do swim-up. A concentração de espermatozóides obtida foi avaliada por densidade óptica. Quer a taxa de fertilização (mínimo: 21,9 ± 8,6%, máximo: 50,8 ± 3,3%%), quer a taxa de sobrevivência embrionária (mínimo: 15,8 ± 4,5%, máximo: 32,6 ± 3,4%) foram influenciadas pelo factor touro. Não existiu correlação entre a taxa de fertilização e a sobrevivência dos embriões (r=0,56; P>0,05). A concentração espermática após o swim-up esteve correlacionada com a taxa de sobrevivência dos embriões (r=0,95; P< 0,05), mas não apresentou correlação com a taxa de fertilização (r=0,44; p>0,05). Touros da mesma raça apresentaram diferenças significativas quer para a taxa de fertilização, quer para a taxa de sobrevivência embrionária. Lotes diferentes do mesmo touro apresentaram taxas de fertilização significativamente diferentes

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VI Congr. Int. Med. Veter. em Língua Portuguesa. Salvador - Bahia (Brasil), 6 a 10 de Dezembro. Poster D16, pp. 264-265 (1993)
ADAPTAÇÃO DE MÉTODO CIRÚRGICO PARA IMPLANTAÇÃO DE CÂNULAS RUMINAIS EM CARNEIROS.

Carla C. Marques, A.E.M. Horta, R. D. Mascarenhas, N. Potes*
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional - INIA
Vale de Santarém, 2000 SANTARÉM
* Universidade de Évora, Departamento de Produção Animal


Descreve-se em seguida um método cirúrgico para implantação de cânulas permanentes em rúmen de carneiros para posteriores estudos de digestibilidade. Esta técnica é uma adaptação do processo descrito por Dierschke e Hyatt (1968), para implantação de uma cânula permanente em ovelhas de modo a permitir repetidas observações peritoneoscópicas nos estudos de actividade ovárica. A cânula por nós utilizada, torneada em ebonite, obedece a uma conformação semelhante à descrita por Megale (1957), sendo composta por um corpo cilíndrico (3,5 cm de diâmetro) provido de rosca exterior, com base anelar larga (8 cm de diâmetro), uma anilha externa e uma tampa. Na primeira fase da intervenção, após anestesia geral do animal, é feito o acesso ao rúmen, após incisão da pele, fasciae, músculos e peritoneu, numa área situada a cerca de 18 cm ventralmente às apófises lombares transversas e à mesma distância do bordo da última costela. Segue-se a clampagem de uma prega ruminal e imediata incisão da mesma. A cânula, cuja tampa foi substituída por um dispositivo cónico de tracção em «nylon», é introduzida na cavidade ruminal pela mão do operador. Avança-se então para a segunda fase da intervenção, que consiste na exteriorização da cânula, numa área circular de 2 cm de diâmetro situada 5 cm atrás da última costela e à mesma distância ventralmente ao bordo da 3ª vértebra lombar. O ajudante do operador inicia a incisão circular interessando a pele, músculos, peritoneu e parede ruminal, enquanto o próprio operador mantém a cânula pressionada contra a parede interna do rúmen. Terminada esta fase, a cânula é exteriorizada por tracção exercida por uma cavilha em forma de «T» que se enrosca numa porca embutida no topo do referido dispositivo cónico. Exteriorizada a cânula, com os tecidos adjacentes cercando-a completamente sob tensão, coloca-se a respectiva anilha, substituindo-se o dispositivo cónico de tracção pela tampa. Seguidamente procede-se à sutura da incisão ruminal de serviço, da parede abdominal e, finalmente, da pele.
Durante o período pós operatório a organização e cicatrização da fístula rumino-cutânea decorreu sem incidentes em todos os animais operados. De 25 animais canulados, apenas seis vieram a rejeitar as cânulas por dilatação do orifício fistular. Nestes casos, que aconteceram sempre após um longo período de utilização, a reintrodução não cirúrgica da cânula é possível quando o acidente ocorre num período de tempo não superior a 12 horas. A longevidade das cânulas após a cirurgia depende muito da frequência da limpeza de resíduos de conteúdo ruminal que podem acumular-se em volta das mesmas quando da tomada de amostras para as respectivas análises. Nos animais em que uma correcta manutenção é tida em consideração, a permanência das cânulas no local de implantação atinge com facilidade os 5 anos, tendo-se verificado uma longevidade de 8 anos num dos animais. Esta técnica permite a organização de fístulas rumino- cutâneas sem recurso a sutura de suporte da zona envolvente à cânula, sendo a justaposição dos tecidos interessados realizada pela compressão da própria cânula.

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VI Jornadas Int. en Reprod. Animal e IA, AERA, pp. 209-215 (1992)
AUSÊNCIA DE FERTILIZAÇÃO EM VACAS ALENTEJANAS SUPEROVULADAS COM PMSG E N-PMSG: RESULTADOS PRELIMINARES.

Lopes da Costa, L.F.(1); Chagas e Silva, J.N.(2); Cidadão, M.R.(2);Marques, C.M.(3); Vasques, M.I.(3); Horta, A.E.M.(3)
(1) - Faculdade de Medicina Veterinária de Lisboa, Bolseiro do INIC
(2) - Estação Nacional de Selecção e Reprodução Animal
(3) - Estação Zootécnica Nacional


Nove vacas de raça Alentejana foram submetidas a tratamentos de superovulação durante a impregnação com Norgestomet (9 dias) com PMSG (2 dias antes da remoção do implante) e Neutral-PMSG (60 horas após a remoção do implante), e indução do estro com PGF2 alfa (no dia da remoção do implante). Cinco animais foram submetidos a IA com sémen da mesma raça (2 IA 12 e 24 horas após o início do cio) e três a cobrição natural. Sete dias após o estro foi realizada a lavagem uterina e pesquisa de embriões. Durante o programa de superovulação foram recolhidas amostras de sangue na veia jugular para doseamento de progesterona (P4) plasmática.
Das 9 vacas, 7 manifestaram comportamento éstrico, numa não houve manifestação do cio mas foi coberta fora das horas de observação e uma foi eliminada por ter perdido o implante.
Das oito vacas tratadas, uma não teve resposta superovulatória (RS), tendo manifestado estro 47 horas após a remoção do implante. Nas sete vacas com RS o intervalo médio entre a remoção do implante e o estro foi de 35 horas variando entre 27,5 e 48 horas. Nos animais com RS, o número médio de corpos lúteos avaliados por palpação rectal no dia da lavagem foi de 8,6 e a média do total de oocitos e embriões recolhidos foi de 7,9. Nestas vacas, a média de oocitos recolhidos foi de 7,4 e a de embriões de 0,43. Os três embriões recolhidos provieram de duas fêmeas submetidas a cobrição natural. Na vaca sem RS foi recolhido um embrião a que correspondeu um corpo lúteo palpável, traduzindo uma fertilização normal.
Excepto numa vaca, os níveis de P4 plasmática encontrados durante a fase folicular não ultrapassaram 0,44 ng/ml. Um dos animais submetido a cobrição natural, embora tenha manifestado cio e ovulado, apresentou uma concentração de P4 igual a 1.57 ng/ml no dia do estro, tendo sido recolhidos 6 oocitos.
Embora se tenha obtido uma taxa de superovulação considerada normal para a espécie, a taxa de fertilização neste ensaio foi muito inferior à conseguida com o mesmo método noutras raças.

Este trabalho foi financiado pelo projecto de investigação nº PMCT/C/AGR/135/90 da JNICT.

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10th Scientific Meeting of the European Embryo Transfer Association, Lyon, p. 210 (1994)
SUPEROVULATION AND IN VIVO EMBRYO PRODUCTION IN INDIGENOUS PORTUGUESE CATTLE

L.F. Lopes da Costa1, I. Vaz2, A.E.M. Horta3, J. Robalo Silva1
1 Faculdade de Medicina Veterinária, R. Gomes Freire, 1100 Lisboa, Portugal
2 Estação de Experimentação Animal do Baixo Alentejo, Vila Nova de S. Bento, Serpa, Portugal
3 Estação Zootécnica Nacional, Vale de Santarém, 2000 Santarém, Portugal


Three different superovulatory treatments (PMSG+Neutra vs. FSH-P vs. SUPEROV) were compared for in vivo cattle embryo production in two endangered Portuguese beef breeds - Alentejano (n=26) and Mertolengo (n=35). The effect of artificial insemination (AI) vs. natural service (NS) on embryo production was also evaluated. Gonadotrophins were administered during Norgestomet synchronization treatments (Crestar method, during 9 days, Intervet) on day 7 (PMSG, 2500 UI, Chronogest, Intervet), 7-9 (SUPEROV, 75 NIH-FSH units, Ausa International) and 7-10 (FSH-P, 36 mg Armour units, Schering). PMSG treated cows received 5 ml of Neutra-PMSG (Intervet) 12 hrs after the onset of heat. PGF2alpha (22.5mg, Prosolvin, Intervet) was given to all animals on the day of implant removal. Embryos were recovered non-surgically (in 2 heifers the procedure was surgical) on day 7 after heat. Qui square tests (with Yates correction) were used to detect statistical differences.
Results show that these breeds seem to respond moderately to superovulation. Viable embryo production was greater after FSH-P than after Superov or PMSG treatments. Heifers provided better production of viable embryos but recovery was only possible by surgical means in 2/5 (40%) of them. Although total ova recovered could be considered acceptable for indigenous breeds, the number of fertilized and viable embryos was low, suggesting blockage of fertilization. IVF/IVM procedures could be an alternative for embryo production in these breeds.

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VI Jornadas Int. en Reproducción Animal e IA, AERA, pp. 343-347 (1992)
USE OF RU486 DURING SUPEROVULATION IN EWES WITH PMSG

Cavaco Gonçalves, S.(1), Marques, C.M., Vasques, M.I., Horta, A.E.M.
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional,
Vale de Santarém, 2000 Santarém, Portugal.

Eleven adult ewes were used in this trial. Two animals (group I) received only an oestrus synchronization treatment (insertion of an intravaginal progestagen pessary for 9 days, PGF2 alfa being administered one day before pessary removal). Six animals were superovulated (group II) and 3 animals received both superovulation and RU486 (progesterone antagonist) treatments (group III). Superovulation consisted on the administration of PMSG (1500 IU) to all synchronized animals on day 8. RU486 was administrated i.m. in a dose of 1mg/Kg body weight on day 9. Blood samples were collected every 2 hrs for a period of 30 hrs, beginning 24 hrs after progestagen removal. Plasma progesterone was measured by RIA. Heat detection was performed every 2 h for 3 days. Laparoscopies were made during the follicular phase.
Animals of group I did not show signs of heat nor ovulations as confirmed by laparoscopies. All superovulated females but one (from group III) showed heat signs after treatment. These heat signs were observed from 24 to 34 hrs after progestagen removal, exception made to one animal of group II which presented the first signs of heat by 44 hours. Plasma progesterone levels were found to be elevated (above 0.5 ng/ml) during follicular phase in two animals (from groups II and III). This is the first time that peripheral plasma progesterone is reported to be elevated in ewes during follicular phase after a superovulation treatment. In both animals, this progesterone is thought to be from follicular origin under PMSG influence, since a drop in the hormone 24 hours after PGF2 alfa administration was found. The ewe with high progesterone profiles from group II (without RU486 administration) presented a delayed period for the beginning of heat. In this female the first signs of heat appeared only after a drop of progesterone to basal levels at 44 hours after progestagen removal. On the other hand, the ewe from group III (receiving RU486) showed signs of heat as early as 24 hours after progestagen removal, in spite of presenting high plasma progesterone levels during all the follicular phase. These results suggest that the inhibition of heat expression by high levels of progesterone may be reversed by the administration of an anti-progesterone treatment (RU486).

(1) Grant-holder nr. BD/1711/91-IE of JNICT
RU486 was donated by Roussel-Uclaf, Romainville, France

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Tese para Investigador Auxiliar, EZN-INIA, (1988)
ACÇÃO DAS PROSTAGLANDINAS SOBRE O MECANISMO DE EXPULSÃO PLACENTÁRIA NA VACA.

A.E.M. Horta
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional
2000 Vale de Santarém - Portugal

Sabe-se que as prostaglandinas (PG) regulam processos fisiológicos e patológicos em vários orgãos através de alterações que provocam sobre a microcirculação, tecido conjuntivo e actividade muscular, entre outras. Como a separação da placenta na vaca é provocada por mecanismos idênticos, decidiu-se investigar a influência de moléculas prostanóides sobre aquele mecanismo, na tentativa de elaboração de uma explicação mais racional da etiologia da retenção placentária (RP) na vaca. Esta influência foi estudada em três experiências através da inibição da biossíntese das PG (1), indução experimental de um desiquilíbrio em PGE2 e PGF2 alfa (2) e avaliação da síntese de PGF2 alfa e de PGI2 (3) durante a terceira fase do parto.
(1) A inibição da biosíntese das PG foi realizada em cinco vacas através da administração de uma droga similar à aspirina, o acetil-salicilato de lisina (ASL). estas vacas receberam 10 gramas de ASL na veia jugular durante 24 horas de 6 em 6 horas com início aos cinco minutos pós-parto (PP). De modo casual, cinco fêmeas receberam um tratamento placebo, servindo de testemunhas. Todas as vacas tratadas com ASL fizeram RP por mais de 24 horas PP, enquanto que no grupo testemunha só uma animal exibiu a condição (P = 2,4 %), tendo as restantes expulsado a placenta nas primeiras 6 horas PP.
(2) O efeito individual da PGE2 e da PGF2 alfa sobre a duração da expulsão placentária e sobre a actividade do miométrio foi estudado em 23 vacas divididas pelos seguintes grupos: I - sete vacas com tratamento placebo; II - cinco vacas receberam ASL (20 g, IV); III - cinco vacas receberam ASL (20 g, IV) e PGE2 (5 mg, IV); IV - seis vacas tratadas com ASL (20 g, IV) e PGF2 alfa (25 mg, IM). Todos estes tratamentos foram administrados duas vezes , aos 5 minutos e às 5 h e 30 min PP. A actividade uterina foi medida às 6 horas PP em 21 das 23 vacas estudadas, através da pressão intra-uterina. O número de vacas com RP nos grupos II e III foi significativamente superior ao grupo I (5/5 e 5/5 vs 1/7, respectivamente; P = 0,75 %). No grupo IV, metade das vacas não apresentou RP, não havendo diferenças significativas em relação ao grupo I (P = 19,58 %). No grupo III, o número de vacas com RP superior a 48 horas PP foi significativamente superior ao dos grupos II e IV (P = 2,88 %). A amplitude máxima das contracções uterinas foi o único parâmetro tocográfico que apresentou diferenças significativas entre tratamentos (39,9; 18,7; 26,8 e 25,3 mmHg, para o grupo I; II; III e IV, respectivamente), sendo os valores obtidos nos grupos II e IV significativamente inferiores aos do grupo I (P< 0,05).
(3) A concentração plasmática periférica dos metabolitos da PGF2 alfa (PGFM) e da PGI2 (PGIM) foi medida por RIA em 8 vacas com RP e em 17 vacas sem RP (NRP) aos 5, 30 e 60 minutos PP. A concentração de PGFM foi significativamente inferior no grupo RP aos 60 min PP (8,2 ng/ml vs 12 ng/ml no grupo NRP; P< 0,05). Entre os 30 e 60 min PP, a concentração a PGFM elevou-se significativamente no grupo NRP (6,2 vs 12 ng/ml, respectivamente; P< 0,05). Nas vacas RP, estas concentrações mantiveram-se estáveis durante o período estudado. Relativamente às concentrações de PGIM não houve diferenças significativas entre os dois grupos, havendo uma tendência para os valores serem superiores no grupo RP. A razão PGFM/PGIM foi significativamente inferior no grupo RP aos 60 min PP (8,8 vs 15,5 no grupo NRP; P< 0,01). A correlação entre PGFM e PGIM foi significativamente positiva no grupo RP (r = 0,76; P< 0,05), enquanto no grupo NRP não houve correlação entre as variáveis consideradas.
Os resultados obtidos sugerem que a síntese de PG durante a terceira fase do parto é uma condição indispensável ao normal funcionamento do mecanismo de separação/expulsão da placenta na vaca. Eles sugerem que a PGF2 alfa exerce uma acção favorável, e a PGE2 e PGI2 uma acção desfavorável, sobre o mecanismo de separação/expulsão placentária. Por outro lado, desequilíbrios na síntese das PG, favorecendo um aumento de PGI2 e provavelmente da PGE2, e uma diminuição de PGF2 alfa durante a 3ª fase do parto, podem estar associados à RP nesta espécie. Finalmente, os efeitos das PG estudadas sobre a duração da RP, não pareceram ser mediados pelas suas acções ao nível da actividade uterina.

PhD-like thesis, EZN-INIA, (1988)
ROLE OF PROSTAGLANDINS ON THE MECHANISM OF PLACENTAL SEPARATION IN THE COW

A.E.M. Horta
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional
2000 Vale de Santarém - Portugal

It is known that prostaglandins (PG) regulate physiological and pathological events in several organs throughout changes on microcirculation, connective tissue and muscular activity, among others. As placental separation in cows is provoked by similar mechanisms, it was decided to investigate the influence of prostanoids on that mechanism in order to find a more rational explanation of the ethiology of placental retention (RP) in the cow. This influence was studied in three experiments through prostaglandin biosynthesis inhibition (1), experimental induction of an imbalance on PGE2 and PGF2 alpha (2) and by measuring PGF2 alpha and PGI2 biosynthesis (3) during the third stage of calving.
(1) The PG biosynthesis inhibition was accomplished in 5 cows by administering an aspirin-like drug, the lysine-acetylsalicilate (LAS). These cows received 10 g of LAS intravenously every 6 hours starting 5 minutes after calving, for 24 hours. Five other cows were randomly assigned for a placebo treatment, and were used as controls. All LAS treated cows presented RP for more than 24 hours while in the controls only one animal showed the same condition (P=2.4%), having the remaining four animals expelled their placenta during the early 6 hours after calving.
(2) The individual effect of PGE2 and PGF2 alpha on the duration of placental expulsion and on myometrial activity, was studied in 23 cows randomly assigned to the following groups: I – 7 placebo cows; II – 5 cows treated with LAS (20 g, i.v.); III – 5 cows treated with LAS and PGE2 (5 mg, intrauterine); IV – 6 cows treated with LAS and PGF2 alpha (25 mg, i.m.). All these treatments were administered twice, at 5 minutes and 5 h 30 min after calving. Myometrial activity was successfully measured at 6 hours after calving on 21 out of the 23 cows by tocographic records of intrauterine pressure. The number of cows with RP in groups II and III was significantly higher than those of group I (5/5 and 5/5 vs. 1/7, respectively; P=0.75%). In group IV, half of the cows did not presented RP, and no significant differences were found regarding group I (P=19.58%). In group III, the number of cows with PR longer than 48 hours was significantly higher than those in groups II and IV (P=2.88%). The maximum amplitude of the uterine contractions was the only tochographic parameter showing significant differences among groups (39.9, 18.7, 26.8 and 25.3 mmHg, respectively in groups I, II, III and IV), the values of groups II and IV being significant lower than those of group I (P<0.05).
(3) The peripheral concentration of PGF2 alpha (PGFM) and PGI2 (PGIM) metabolites was measured by RIA in 8 cows with and 17 cows without RP (NRP) at 5, 30 and 60 minutes after calving. PGFM concentrations were significantly lower in RP cows at 60 min (8.2 vs. 12 ng/ml; P<0.05). Between 30 and 60 min, PGFM levels rose significantly in NRP cows (6.2 vs. 12 ng/ml; P<0.05). In RP cows these levels were maintained stable during the studied period. Regarding PGIM levels no significant differences were found between NRP and RP cows, but the values in RP cows tended to be higher. The ratio PGFM/PGIM was significantly lower in RP cows at 60 min (8.8 vs. 15.5; P<0.01). The correlation between PGFM and PGIM during the studied period was significantly positive in RP cows (r=0.76; P<0.05), but not in NRP cows.
The results suggest that PG synthesis during the third stage of labour plays an essential role for the expulsion/separation of the placenta in cows. They further suggest that PGF2 alpha contributes for placental separation, PGE2 and PGI2 both having a negative role upon that mechanism. An imbalance on PG synthesis, leading to higher concentrations of PGI2 and probably PGE2 and lower concentrations of PGF2 alpha during the third stage of labour, seems to be associated to placental retention in this species. Finally, the effects of the studied PG on placental retention do not seem to be mediated by their effect on myometrial activity.

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II Cong. Int. Veter. Língua Portuguesa, Lisboa (1980)
VARIAÇÃO DA ACTIVIDADE SEXUAL DE CARNEIROS MERINO PRECOCE E FRISSERRA.
[Seasonal variation on the sexual activity of Merino and Frisserra rams]

Mascarenhas, R.D., Robalo Silva, J., Horta, A.E.M. e Leitão, R.M.
Estação Zootécnica Nacional, 2000 Vale de Santarém, Portugal

In the present work, the sexual activity of Merino Precoce and Frissera rams was assessed by studing sexual behaviour (libido) and seminal parameters.
There was no seasonal variation of sexual behaviour along the year of study. There was a slight variation in semen parameters, but they were within the normal threshold values for the concerned species.
The results above suggest that the rams of the concerned breeds may be used in reproduction throughout the year, although studies of fertility merit further research.

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Rev. Port. Ciênc. Veter., 76: 207-212 (1981)
ACÇÃO DO ACETIL-SALICILATO DE LISINA SOBRE A EXPULSÃO DA PLACENTA EM BOVINOS.
[Action of lysine acetil-salicylate on placental expulsion in cattle]

Horta, A.E.M.
Estação Zootécnica Nacional, 2000 Vale de Santarém, Portugal

The aim of this work is to know whether the prostaglandin biosynthesis inhibition during the third stage of labour in the cow, using an aspirin-like drug, the lysine acetil- salicylate (10 g in 20 ml of H2O in the jugular vein), would be a limitant factor on the expulsion of the fetal membranes.
All treated animals (n=5) retained their placenta later than 24 hours, whereas in the control group placebo (n=5) only one animal showed the same condition, having the other four cows released their placenta within the early 6 hours after calving.
These data suggest that any of the prostaglandins from serial 2 (or the unstable endoperoxides, PGG2 and PGH2), seem to play a fundamental role on the expulsion of the afterbirth in the cow.

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XXXVIII Annual Meeting of the EAAP, Lisboa. Vol. I, p. 584 (1987)
COMPLETION OF UTERINE INVOLUTION AND ONSET OF POSTPARTUM OVARIAN ACTIVITY AND THEIR CORRELATION WITH RETAINED PLACENTA AND METRITIS IN DAIRY COWS.

Carla Marques, C. and Horta, A.E.M.
Estação Zootécnica Nacional, 2000 Vale de Santarém, Portugal

Twenty five pluripara cows were checkedfor uterine postpartum involution (UPPI) by rectal palpation and for the onset of ovarian activity (OAA) by progesterone measurements. Percent incidence of metritis and retained placenta was 32 and 36 respectively. Cows were hence assigned into normal postpartum (NPP), metritis (M) and retained fetal membranes (RFM) groups. The days interval from calving to completion of UPPI was significantly higher in RFM (48,2 ± 10,0) than in NPP (33,1 ± 10,1) and M cows (36,1 ± 6,0), for P< 0,05. The days interval to OAA was also significantly higher in RFM (36,4 ± 5,0) than in NPP (27,2 ± 6,2) and M cows (22,8 ± 5,0), for P< 0,05. No significant differences were found for the intervals UPPI and OAA between NPP and M groups. Results obtained confirm a direct effect of placental retention in lasting uterine involution and the onset of postpartum ovarian cyclicity in dairy cows.

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Xth Int. Cong. Anim. Reprod. AI, Urbana, Illinois, Vol. I - Abst., p. 413, Vol.II. (Brief Communic.), p. 413 (1984)
A SUMMARY OF STUDIES CONCERNING THE EFFECTS OF PROSTAGLANDIN SYNTHESIS INHIBITION, PGE2 E PGF2 ALPHA, ON THE EXPULSION OF PLACENTA AND MYOMETRIAL ACTIVITY IN THE COW.

Horta, A.E.M.
Estação Zootécnica Nacional, 2000 Vale de Santarém, Portugal


In order to know whether prostaglandins (PGs) were implicated in the physiologic process of placental detachment in the cow, it was first performed an in vivo study (1) in which PG synthesis was inhibited in five cows by giving them aspirin under its lysine salt form, during the 24 h post-partum. Aspirin was given every six hours starting five minutes after fetal expulsion at individual dose-rates of 10 g, i.v.. Randomly five other cows served as a placebo control group. All aspirin treated cows presented placental retention (PR) later than 24 h (P< 0,001). Further information was obtained in a second experiment (2) where 23 friesen cows received four different treatments also at random, as follows: pacebo (n=7); Lysine-Acetylsalicylate alone (LAS, 20 g IV, n=5); LAS plus PGE2 (5 mg IU, n=5) and LAS plus PGF2 alpha (25 mg IM, n=6). All these individual doses were given twice at 5 mn and 5 h 30 mn PP. Uterine contractions were recorded in all cows during the 6 th hour PP. Treatment with Las alone induced PR later than 12 h PP in all cows (P=0,75%) which was acompanied by a significant reduction in the amplitude of the uterine contractions (P< 0.05). PR induced by LAS was potentialized by PGE2 treament later than 48 h PP (P=2,88%) although no significant differences were found in tocographic parameters in relation to placebo (P>0,05). On the other hand, PGF2 alpha treatment prevented PR, in 50% of the cows (P< 0.05) but couldn't prevent a significant reduction of the amplitude of the contractions induced by LAS (P>0.05).
The results suggest that PGs may be necessary for normal placental detachment, since it is known that the mechanism of action of aspirin-like drugs fits within a ciclooxigenase inhibition. It is further suggested that during the normal detachment process of the placenta in cattle it seems to exist a balanced mechanism of PG biosynthesis probably throughout some preferential pathway (s) in order to favour the synthesis of some PG (s) conducting to a better detachment of the fetal cotyledons and/or preventing the synthesis of deleterious PG (s) as it seems to be the case of PGE2. Probably PR may be originated by factors which induce PGE2 preferential synthesis either directly or indirectly by inhbiting some other indispensable pathway (s). Hysterographic records during the 6 th hour PP finally suggest that PR is not necessarily acompanied by a lack or reduction in the strength of the uterine contractions.

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