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3º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, Porto, 6-8 Jul/2001
EFEITO DO TIPO DE DILUIDOR E ÉPOCA DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM OVELHAS DE RAÇA SALOIA SOBRE A FERTILIDADE, PROLIFICIDADE E FECUNDIDADE.

J.P. Barbas, R.D. Mascarenhas, H. Tavares*, C. Cannas-Serra*, L. Cardigos*, R. Moura*, J.P. Cannas Simões**
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional-INIA, 2000-763 Vale de Santarém
*Direcção Regional do Ribatejo e Oeste, 2000 Santarém
**Associação Criadores de Bovinos da Raça Preta, Ap 118, 2135 Samora Correia

RESUMO

A inseminação artificial (IA) é uma técnica essencial na selecção e melhoramento genético através da melhor utilização de animais geneticamente superiores. A sua divulgação permite um controlo mais eficaz das doenças sexualmente transmissíveis. Nos ovinos o desenvolvimento da IA tem sido limitado por diversos factores nomeadamente a conformação anatómica do aparelho genital da ovelha que dificulta a IA intra-uterina por via cervico-vaginal e por ser uma técnica que requer pessoal e equipamento especializado. Este trabalho foi realizado com ovelhas de raça Saloia mantidas em pastoreio e exploradas na função leiteira. A indução e sincronização do estro foi efectuada com esponjas vaginais contendo 40 mg de FGA (Chronogest ®), sendo administrados 500 UI de PMSG (Intergonan ®) no momento da sua retirada. O sémen foi recolhido com vagina artificial e determinada a sua concentração com um espectrofotómetro calibrado para a espécie ovina. Só foram utilizados na IA, ejaculados com mobilidade massal >= 3 e percentagem de espermatozóides móveis >= 70 %. Foram inseminadas 296 ovelhas (sem prévia detecção de estro) repartidas por três grupos, dois inseminados na Primavera (Abril; n=197) e um inseminado no Outono (Setembro; n=99). Em cada grupo foram testados dois diluidores de sémen, um à base de leite de vaca desnatado e outro de solução Tris adicionado de 1,5 % de gema de ovo. As ovelhas foram inseminadas uma só vez com uma dose (0,25 ml) de sémen refrigerado (+15 ºC) contendo 300 milhões de espermatozóides totais, 55 horas após a remoção das esponjas vaginais.
Globalmente (n=296), a fertilidade, a prolificidade e a fecundidade foram respectivamente 33 %, 145 % e 48 %. Quando foi utilizado o diluidor de leite de vaca desnatado (n=141) a fertilidade, a prolificidade e a fecundidade foram respectivamente 39 %, 156 % e 61 %. Nas ovelhas (n=155) em que foi utilizado o diluidor contendo Tris adicionado de 1,5 % de gema de ovo os parâmetros correspondentes foram 28 %, 130 % e 36 %.
As ovelhas inseminadas em Setembro parecem ter uma maior fertilidade vs as inseminadas em Abril (39 % vs 31 % vs 29 %), embora as diferenças não fossem significativas. A utilização do diluidor de leite de vaca desnatado permitiu um aumento significativo da fertilidade (p<0,06), da prolificidade (p<0,02) e da fecundidade (p<0,02).



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3rd Iberian Congress on Animal Reproduction, Porto, 6-8 Jul/2001
EFFECT OF DIFFERENT RAM SEMEN EXTENDERS AND SEASON OF ARTIFICIAL INSEMINATION ON FERTILITY, PROLIFICACY AND FECUNDITY IN SALOIA BREED

J.P. Barbas, R.D. Mascarenhas, H. Tavares*, C. Cannas-Serra*, L. Cardigos*, R. Moura*, J.P. Cannas Simões**
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional-INIA, 2000-763 Vale de Santarém
*Direcção Regional do Ribatejo e Oeste, 2000 Santarém
**Associação Criadores de Bovinos da Raça Preta, Ap 118, 2135 Samora Correia

SUMMARY

Artificial insemination (IA) is a reproductive technique essencial in animal genetic selection and management due to the utilization of genetically superior breeds. Its practice allows an efficient control of sexually transmissible diseases. IA has been limited in sheep by several factors, namely some anatomic characteristics of ewes genitalia, transforming intra-uterine insemination through cervix extremely difficult in these species. This technique also requires specialized personnel and equipment. This trial was performed in Saloia ewes kept in pasture and explored for milk production. Oestrus was induced and synchronized with 40mg FGA vaginal sponges (Chronogest ®) during 12 days and 500 UI PMSG (Intergonan ®) were administered at sponge removal. Sperm was collected by an artificial vagina and its concentration was determined by a spectrophotometer calibrated for ovine sperm. Only sperm with motility rates superior to 70% and a mass motility >= 3 are used in IA. Two hundred and ninety six (296) ewes were inseminated (without previous oestrus detection) and randomly allotted to three groups, two of them inseminated in Spring (April, n=197) and the last one inseminated in Autumn (September, n=99). In each group two different sperm extenders were tested, skim milk and TRIS with 1.5% of yolk. Ewes were inseminated approximately 55 hours after sponge removal with only one dosis (0.25 ml) of refrigerated sperm (+15ºC) with a concentration of 300 millions of spermatozoa.
Globally, fertility, prolificacy and fecundity were 33, 145 and 48%, respectively. When the extender with cow milk (n=141) was used, fertility, prolificacy and fecundity were 39, 156 and 61%, respectively. Averages were 28, 130 and 20% for fertility, prolificacy and fecundity when TRIS was used.
In conclusion, ewes inseminated in September showed higher values for fertility than animals inseminated in April (39% vs. 31% vs. 29%), although differences were not significant. Extender with skim milk allowed a significant increase in fertility (P=0.06), prolificacy (P=0.02) and fecundity (P=0.02) rates.




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3º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, Porto, 6-8 Jul/2001
EFEITO LUTEOTRÓFICO DE EMBRIÕES BOVINOS E DO ÁCIDO ARAQUIDÓNICO (AA) EM CÉLULAS DA GRANULOSA CULTIVADAS IN VITRO.

R.M. Pereira, M.I. Vasques; T.P. Cunha; C.C. Marques, M.C. Baptista e A.E.M. Horta.
Estação Zootécnica Nacional - INIA, Departamento de Fisiologia e Reprodução Animal, 2000 Vale de Santarém

RESUMO

Pretendeu-se estudar a influência do AA e embriões na produção de progesterona (P4) pelas culturas de células da granulosa em monocamada. As concentrações de P4 (ng/mL) no meio de cultura de monocamadas de células da granulosa ao longo da cultura, com e sem AA e na presença (n=7) ou ausência (n=4) de embriões, foram doseadas por radioimunoensaio (RIA). Vinte e duas horas após a inseminação in vitro dos oócitos, os zigotos foram divididos em dois grupos e colocados nas monocamadas, prosseguindo o seu desenvolvimento até 12-13 dias de idade. No momento da transferência, as células da granulosa já tinham 2 dias de cultura suplementadas ou não com AA, tratamento que se manteve durante duas semanas.
Os resultados mostram que a introdução do AA no meio de cultura das células da granulosa não origina diferenças significativas na produção de P4 para cada dia de cultura (Dc) entre células tratadas e não tratadas. De facto, ao contrário do que acontece com a testemunha, onde a síntese desta hormona aumenta significativamente ao longo da cultura (3,3 e 41,9 ng/mL, em Dc0 e Dc14; P<0,005), nas células tratadas com AA, as concentrações de P4 não diferem entre si para qualquer dia de cultura (3,3 e 26,9 ng/mL, em Dc0 e Dc14; P>0,05). A presença de embriões em co-cultura com as células da granulosa aumenta significativamente a produção de P4 a partir de Dc4, quando comparado com a produzida pelas células da granulosa no mesmo dia de cultura sem embriões (33,6 vs. 61,9 ng/mL, em Dc4, respectivamente; P<0,02). Este aumento da produção de P4 também se verifica com a introdução dos embriões nas monocamadas de células da granulosa refrescadas com AA (20,3 vs. 46,3 ng/mL, em Dc4, respectivamente; P<0,04). A produção de P4 pelas células da granulosa na presença dos embriões apresenta uma curva bifásica com um aumento até Dc4-5, seguindo-se um período em que esta produção estabiliza, para voltar a aumentar a partir de Dc11 até ao fim da cultura. Este último aumento é menos pronunciado no presença de AA.
As células da granulosa em cultura diferenciam-se exibindo características de células lúteas. Esta luteinização é influenciada pela presença do AA e dos embriões. O AA diminuiu a capacidade de síntese de P4 por parte das células da granulosa. Os embriões apresentaram um efeito luteotrófico inequívoco traduzido por uma produção acrescida de P4 de acordo com o estadio de desenvolvimento embrionário. O atraso do desenvolvimento embrionário provocado pelo AA que conduz à diminuição da taxa de extrusados, origina a diminuição do 2º incremento de P4 correspondente à passagem de blastócito expandido para eclodido.



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3rd Iberian Congress on Animal Reproduction, Porto, 6-8 Jul/2001
LUTEOTROPHIC EFFECT OF BOVINE EMBRYOS AND ARACHIDONIC ACID (AA) ON IN VITRO CULTURED GRANULOSA CELLS

R.M. Pereira, M.I. Vasques; T.P. Cunha; C.C. Marques, M.C. Baptista e A.E.M. Horta.
Estação Zootécnica Nacional - INIA, Departamento de Fisiologia e Reprodução Animal, 2000 Vale de Santarém

SUMMARY

It was evaluated the influence of AA and bovine embryos on progesterone production by in vitro cultured granulosa cells. Progesterone levels (ng/ml) in culture medium of granulosa cell monolayers, supplemented or not with AA with (n=7) or without (n=4) embryos, were measured by RIA throughout culture. Twenty two hours after in vitro insemination, ova were randomly allotted into two groups and transferred to monolayers of granulosa cells until day 12-13 of embryo development. At the moment of ova transfer, granulosa cell monolayers have been previously in culture for two days with or without AA supplementation. AA supplementation lasted for two weeks.
Results show that the addition of AA to culture medium of granulosa cell monolayers does not induce significant changes in progesterone production at any day of culture (Dc) when compared to controls. However, progesterone synthesis significantly increases throughout culture in Control group (3.3 and 41.9 ng/ml at Dc0 and Dc14; P< 0.005), but its levels do not significantly differ at each day of culture when cells are supplemented with AA (2.6 and 26.9 ng/ml, at Dc0 and Dc14; P> 0.05). Co-culture of embryos with granulosa cells significantly increases progesterone levels in culture medium at Dc4, when compared to progesterone production by granulosa cells without embryos at the same day (33.6 vs. 61.9 ng/ml, at Dc4, respectively; P< 0.02). This progesterone rise is also observed when embryos are transferred to monolayers of granulosa cells supplemented with AA (20.3 vs. 46.3 ng/ml, at Dc4, respectively; P<0.04). Progesterone production by granulosa cells co-cultured with embryos presents a biphasic curve, increasing from Dc0 to Dc4-5, maintaining its production from Dc4-5 to Dc11, and increasing again at Dc11 to the end of culture. This second increase in progesterone production is induced by embryo transition stage from expanded blastocyst to hatched blastocyst and is lower when culture is supplemented with AA.
In vitro cultured granulosa cells differentiate by exhibiting luteal cell properties. Luteinization of granulosa cells is affected by the presence of embryos and AA. AA has detrimental effects on progesterone production by granulosa cells. Luteotrophic influence of embryos is clearly confirmed by an increase in progesterone production by granulosa cells depending on the stage of embryo development. A delayed embryo development due to the presence of AA, associated with a lower hatched blastocyst rate, induces a lower second increase in progesterone production by granulosa cells in vitro.




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3º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, Porto, 6-8 Jul/2001
EFEITO DA APLICAÇÃO VAGINAL DE AGENTES DILATADORES DO CÉRVIX DURANTE A FASE FOLICULAR DO CICLO EM OVELHAS

J.P. Barbas, S.C. Gonçalves, C.C. Marques, A.E.M. Horta
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional - INIA, 2000-763 Vale de Santarém

RESUMO

Pretendeu avaliar-se o efeito da aplicação vaginal de agentes dilatadores do cérvix, sobre o relaxamento muscular e dilatação do colo uterino de ovelhas em estro, visando uma melhor progressão espermática após a inseminação artificial (IA). Setenta e sete ovelhas cíclicas foram submetidas a um tratamento de sincronização do estro e indução da ovulação. Em 56 ovelhas, foram utilizados os seguintes tratamentos: testemunha (n=17), o antagonista da progesterona (P4) aglépristone (n=8), um preparado comercial de ocitocina (n=7), o análogo sintético da prostaglandina E1 (PGE1) misoprostol (n=4), o agonista dos receptores b-adrenérgicos sulfato de terbutalina (n=6) e a associação misoprostol + terbutalina (n=14), todos eles administrados por via vaginal e depositados próximo do os cervical. Os tratamentos foram realizados 36 e 56 horas após a remoção das esponjas (REV), após o que se avaliou a penetrabilidade cervical aos 0, 15, 30, 60, 90 e 120 minutos com um estilete. Na avaliação realizada 56 horas após REV não foram considerados os dois últimos registos.
A penetrabilidade cervical ao longo do tempo, só registou aumentos significativos entre a leitura inicial e as restantes, no grupo misoprostol + terbutalina, quer às 36 h (22,5 vs. 23, 23,4, 23,5, 23,6 e 23,6 cm, P< 0,05), quer às 56 h (22,9 vs. 23,6, 24 e 24,2 cm, P< 0,05). Relativamente ao grupo testemunha, o aglépristone foi único tratamento isolado que provocou um aumento significativo da penetrabilidade e somente aos 15 minutos na sessão das 36 horas (23,5 vs. 22,5 cm, P< 0,05). A associação misoprostol + terbutalina apresentou aumentos significativos relativamente à testemunha, em todas as leituras com excepção da inicial, às 36 h e às 56 horas. Nos animais pertencentes aos vários grupos em estudo (n=56), não foram observadas diferenças significativas relativamente ao intervalo remoção das esponjas vaginais pico de LH, cujo intervalo médio foi de 46,13 ± 7,57 horas. O misoprostol, a terbutalina e a sua associação não afectaram as características seminais in vitro. O sémen tratado com misoprostol apresentou um valor médio (leituras aos 0, 30 e 60 minutos) de 59% de espermatozóides (spz) vivos e 66,3% de spz móveis, que não foram diferentes dos observados no sémen testemunha (69,2% e 66,6%, respectivamente). O tratamento do sémen com terbutalina não conduziu igualmente a diferenças significativas, quer para a % de spzs vivos (78% vs. 74,2%), quer móveis (67% vs. 65,7%). A associação dos dois fármacos (misoprostol mais terbutalina) não influenciou significativamente qualquer dos parâmetros em estudo, tendo a % média de spz vivos e a % média dos spz móveis sido de 76% e 65% no grupo tratado e de 77% e 66,3% no testemunha.
Daqui concluiu-se que as drogas utilizadas são inócuas quanto às características seminais avaliadas. A associação de um b-agonista e da PGE1 provoca um aumento da penetrabilidade cervical sem afectar as características seminais in vitro.



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3rd Iberian Congress on Animal Reproduction, Porto, 6-8 Jul/2001
EFFECTS OF INTRAVAGINAL APPLICATION OF CERVICAL DILATATION AGENTS DURING OESTROUS FOLLICULAR PHASE IN EWES

J.P. Barbas, S.C. Gonçalves, C.C. Marques, A.E.M. Horta
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional -INIA, 2000-763 Vale de Santarém

SUMMARY

This study was conducted to determine the effect of intravaginal application of cervical ripening agents on estrous sheep cervical softening and dilatation, envisaging the efficient sperm transport throughout the uterus into the oviducts after artificial insemination (IA). Seventy-seven (77) ewes were submitted to estrous synchronization treatments. Fifty-six (56) animals were then assigned to the following treatment groups: Control (n=17), progesterone antagonist aglépristone (n=8), oxytocin (n=7), synthetic prostaglandin E1 analoge misoprostol (n=4), b-adrenergic receptor agonist terbutalin sulphate (n=6) and the association misoprostol+terbutalin (n=14). All the products were given intravaginally into the cervical os at 36 and 56 hours after pessary removal (REV). Depth of cervical penetration (cm) with a graduated stainless steel rod was measured at 0, 15, 30, 60, 90 and 120 minutes after each treatment. The two last measurements at 56 hours after REV were not considered.
Depth of cervical penetration increased significantly along measurements in group misoprostol+terbutalin, either at 36 hours (22.5 vs. 23, 23.4, 23.5, 23.6 and 23.6 cm; P< 0.05) or 56 hours (22.9 vs. 23.6, 24 and 24.2 cm, P< 0.05) post REV. At 36 hours post REV, aglépristone group showed significantly higher values of cervical penetration at 15 minutes than control (23.5 vs. 22.5 cm; P< 0,05). Except at 0 minutes, misoprostol+terbutalin treatment either at 36 or 56 hours after REV significantly induced deeper cervical penetration than control group. There were no significant differences in the interval from REV to LH surge among all groups (46.13 ± 7.57 hours). Neither misoprostol, terbutalin or their association affected in vitro sperm characteristics. Sperm treated with misoprostol presented live sperm (59%) and motility (66.3%) rates not significantly different from control group (69.2 and 66.6%, respectively). Treatment with terbutalin did not affect live sperm (78 vs.74.2% in control group) and motility (67 vs. 65.7 % in control) rates, neither did treatment with misoprostol+terbutalin (76 vs. 65% for live sperm and 77 vs. 66.3% for motility rates, in treated and control groups, respectively).
These results suggest that the drugs do not influence sperm characteristics. The association of a b-agonist and PGE1 induces an increase on cervical penetration during estrus in ewes without affecting in vitro sperm survival.




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3º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, Porto, 6-8 Jul/2001
PAPEL DAS PROSTAGLANDINAS NA FASE INICIAL DA CAPACITAÇÃO ESPERMÁTICA EM BOVINOS

M.C. Baptista, C.C. Marques, R.M. Pereira, M.I. Vasques, A.E.M. Horta.
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional -INIA, 2000-763 Vale de Santarém

RESUMO

A presença do enzima ciclooxigenase responsável pela síntese das prostaglandinas (PGs), na cabeça e peça intermédia de espermatozóides (spz) bovinos, sugere a participação destas moléculas nos processos de maturação dos spz, que condicionam a fertilização e posterior desenvolvimento embrionário. Pretendeu-se determinar a influência da inibição da síntese das PGs pela indometazina (Indo), da PGF2α (Indo+PGF2α) e da PGE1 (Indo+PGE1) suplementadas ao meio de swim-up (CAP: Meio Tyrodes s/ Ca c/ cafeína), sobre a taxa de fertilização, desenvolvimento e qualidade dos embriões produzidos in vitro. O trabalho desenvolveu-se ao longo de 9 sessões em que foram inseminados 1727 oócitos com sémen tratado da seguinte forma: Grupo testemunha com 417 oócitos, inseminados com spz capacitados em meio CAP sem qualquer suplementação; Grupo Indo com 438 oócitos inseminados com spz capacitados em meio CAP suplementado com Indo (28 µM); Grupo Indo+PGE1 com 432 oócitos inseminados com spz capacitados em CAP suplementado com Indo (28 µM) e PGE1 (1,4 x 10-7 M) e Grupo Indo + PGF2α com 440 oócitos inseminados com spz capacitados em meio CAP, suplementado com Indo (28 µM) e PGF2α (1,4 x 10-7 M). Foi utilizada uma concentração espermática de 1x106 spz/mL para a inseminação. Após 22 horas de incubação os oócitos inseminados foram transferidos para um sistema de co-cultura com células da granulosa (TCM 199 + 10% soro de vaca superovulada) e às 48 horas avaliou-se a clivagem, tendo-se acompanhado o desenvolvimento embrionário até à fase de extrusão. A qualidade dos embriões foi avaliada ao 8º dia de desenvolvimento utilizando uma escala que variou de grau 1 (muito bom) a grau 4 (mau).
Os resultados mostram que a ausência de prostaglandinas (grupo Indo) nesta fase de preparação dos spz prejudica o processo de fertilização, quando comparados com os do grupo testemunha (45,0% vs.54,0%; P< 0,009). A PGE1 actuando isoladamente, consegue inverter a acção negativa da Indo (51,2% vs. 54,0%; P> 0,05) e a PGF2α; tem um efeito ainda mais prejudicial que a Indo (38,4% vs. 54,0% e 45,0%; P< 0,0001 e P< 0,05, para o grupo testemunha e Indo, respectivamente). Quanto ao desenvolvimento embrionário verificou-se um atraso no crescimento dos embriões pela ausência das prostaglandinas e quando há desequilíbrios favoráveis à PGF2α. A inibição da síntese de prostaglandinas durante a fase inicial de capacitação dos spz provocou um decréscimo significativo na qualidade dos embriões face ao grupo testemunha, não tendo nenhuma das prostaglandinas utilizadas conseguido inverter este efeito negativo. Das duas PGs testadas, a PGE1 foi a que apresentou piores resultados relativamente à qualidade de embriões transferíveis. Conclui-se que as prostaglandinas desempenham um papel determinante durante a fase inicial de capacitação espermática in vitro com repercussões na taxa de fertilização desenvolvimento e qualidade dos embriões. A PGE1 e a PGF2α mostraram acções opostas face ao processo de capacitação, com reflexos na fertilização.



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3rd Iberian Congress on Animal Reproduction, Porto, 6-8 Jul/2001
EFFECT OF PROSTAGLANDINS ON THE FIRST STAGE OF IN VITRO BOVINE SPERM CAPACITATION

M.C. Baptista, C.C. Marques, R.M. Pereira, M.I. Vasques, A.E.M. Horta.
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional -INIA, 2000-763 Vale de Santarém

SUMMARY

Ciclooxygenase is responsible for prostaglandin (PG) synthesis in bovine sperm head and mid-piece, suggesting that these hormones are present throughout all stages of sperm maturation. Sperm maturation is essential to occur for oocyte fertilisation and embryo development. The purpose of this study was to determine the effect of a PG synthesis inhibitor (Indomethacin, Indo), PGF2α (Indo+PGF2α) and PGE1 (Indo+PGE1), added to the swim-up medium (CAP medium: calcium-free TALP+caffeine), on in vitro embryo fertilisation rates and embryo development and quality. Treatments were performed as follows (9 trials, a total of 1727 oocytes inseminated): Control group (417 oocytes inseminated with capacitated sperm in CAP without supplementation); Indo group (438 oocytes inseminated with capacitated sperm in CAP + 28 µM Indo); Indo + PGE1 (432 oocytes inseminated with capacitated sperm in CAP + 28 µM Indo + 1.4 x 10-7 M PGE1) and Indo+PGF2α (440 oocytes inseminated with capacitated sperm in CAP + 28 µM Indo + 1.4 x 10-7 M of PGF2α). A final sperm concentration of 1x106 sperm/mL was used for insemination. After 22 hours of incubation, embryos were transferred to a co-culture system consisting of 1x106 granulosa cells/mL in TCM199 + 10% oestrus superovulated cow serum. Embryos were evaluated for cleavage by 48 hours after insemination and throughout development from D8 until the hatched blastocyst stage. Embryo quality was also assessed at D8 and embryos were classified from grade1 (very good) to grade 4 (poor).
Results indicate that the absence of PG (Indo group) at this stage of sperm maturation had a detrimental effect on subsequent oocyte fertilisation rates (45.0% vs 54.0% in control group; P<0.009). PGE1 in group Indo+PGE1 was able to reverse the negative effect of indomethacin (51.2% vs 54% in control group; P>0.05). PGF2α had an even higher detrimental effect on fertilisation rates than indomethacin (38.4% vs 54% and 45.0%; P< 0.0001 and P< 0.05, for control and Indo groups, respectively). Total PG inhibition and supplementation with PGF2α delayed embryo development. PG inhibition at the first stage of sperm capacitation also lowered embryo quality at D8 of culture as opposed to control group and none of the tested PG could reverse this negative influence. Transferable embryos of group PGE1 presented the worst quality of all groups. We can conclude that prostaglandins play an essential role during the very first stage of in vitro sperm capacitation, this effect being extended as far as oocyte fertilisation and embryo development are concerned. PGE1 (+) and PGF2α (-) have opposite actions upon capacitation mechanisms, influencing oocyte fertilisation rates accordingly.




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3º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, Porto, 6-8 Jul/2001
EFEITO DO ÁCIDO ARAQUIDÓNICO (AA) NO DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES EM CO-CULTURA COM CÉLULAS PLACENTÁRIAS.

R.M. Pereira, C.C. Marques, M.C. Baptista; M.I. Vasques e A.E.M. Horta.
Estação Zootécnica Nacional - INIA, Departamento de Fisiologia e Reprodução Animal, 2000 Vale de Santarém

RESUMO

O AA é o precursor dos eicosanóides, podendo ser metabolizado pelos embriões e células em co-cultura. Testou-se o efeito do AA em diferentes estadios do desenvolvimento de embriões bovinos cultivados em monocamadas de células trofoblásticas da placenta. Foram realizadas duas experiências em que se suplementou o meio de cultura com 100 µM de AA utilizado para refrescar os embriões ao longo de toda a cultura (experiência 1) ou apenas até aos 3 dias de idade (Experiência 2). Em ambas as experiência, 22 horas após a inseminação in vitro dos oócitos (D0=dia da inseminação), os zigotos foram divididos em dois grupos (Exp. 1 - testemunha n=341 e PlacAA n=391; Exp. 2 - testemunha n=586 e PlacAAD3 n=576) e introduzidos nas monocamadas, prosseguindo o seu desenvolvimento até aos 12-13 dias de idade. No momento da transferência, as células placentárias já tinham uma semana de cultura com ou sem AA, continuando a suplementação com AA ao longo de toda a cultura na experiência 1 e, apenas até aos 10 ou 11 dias de cultura, na experiência 2.
Na experiência 1, a suplementação dos meios de cultura de embriões com AA não influenciou significativamente a taxa de embriões clivados, em D7 e D8. No entanto, diminuiu a qualidade dos embriões (mais embriões maus e menos médios que a testemunha) e a taxa de embriões extrusados (P=0,06) e atrasou o desenvolvimento embrionário. Para além do atraso verificado, o número total de embriões sofreu uma grande redução entre D7 e D10. Na experiência 2, a suplementação dos meios de cultura com AA até aos 3 dias de idade dos embriões aumentou significativamente a taxa de clivagem (65,4 vs. 71,7%, P=0,02), não havendo diferenças quanto às taxas e qualidade dos embriões, nem atraso no desenvolvimento embrionário.
O AA apresenta uma acção bifásica, positiva no desenvolvimento dos embriões até ao estadio de mórula, prejudicando o seu desenvolvimento posterior. Esta acção prejudicial verifica-se logo após o estadio de mórula, com uma grande redução da formação de blastócitos e blastócitos expandidos e ausência de embriões extrusados. A qualidade dos embriões também é reduzida. Os efeitos negativos do AA desaparecem quando este é adicionado apenas até ao 3º dia do desenvolvimento embrionário, sugerindo a síntese de algum ou alguns de seus metabolito(s), que embora benéficos para o início desse desenvolvimento, o prejudicam numa fase mais tardia.



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3rd Iberian Congress on Animal Reproduction, Porto, 6-8 Jul/2001
EFFECT OF ARACHIDONIC ACID (AA) ON IN VITRO BOVINE EMBRYOS CO-CULTURED WITH PLACENTAL CELLS

R.M. Pereira, C.C. Marques, M.C. Baptista; M.I. Vasques e A.E.M. Horta.
Estação Zootécnica Nacional - INIA, Departamento de Fisiologia e Reprodução Animal, 2000 Vale de Santarém


SUMMARY

Arachidonic acid (AA) is a precursor of eicosanoids metabolized by embryos and cells in co-culture. It was evaluated the effect of AA on different stages of bovine embryo development co-cultured with placental trophoblastic cells. Embryo culture medium was supplemented with 100 µM AA from Day 0 (D0) of embryo development to D13-D14 in Experiment 1, or from D0 to D3 of embryo development in Experiment 2. In both experiments, 22 hours after in vitro insemination, ova were randomly allotted into two groups (Exp. 1: Control group, n=341 and PlacAA, n=391; Exp. 2: Control group, n=586 and PlacAAD3, n=576) and transferred to monolayers of placental cells until day 12 or 13 of embryo development. At the moment of ova transfer placental cell monolayers have been previously in culture for seven days, supplemented or not with AA, and this supplementation continued to the end of culture in Exp. 1 or only to day 10-11 of cell culture in Exp. 2.
In Exp. 1, AA added to embryo culture medium did not significantly affected ova cleavage rate and embryo rates at D7 and D8. Nevertheless, later embryos showed lower quality rates (higher number of bad, and less medium quality embryos), lower extrusion rates (P=0.06) and delayed embryo development. Embryos from D7 to D10 also suffered a great reduction in number. In Exp. 2, AA supplementation from D0 to D3 of embryo development significantly increased ova cleavage rate (65.4% vs. 71.7%, P=0.02), and no significant differences in embryo number and quality at D7-8 were found. Also, no delay in embryo development was showed in this experiment.
Arachidonic acid induces a biphasic effect on embryo development, positive from cleavage stage to morula, and a negative one from morula onwards. This detrimental effect is evident immediately after morula stage, as confirmed by a great reduction in blastocyst and expanded blastocyst production. Embryo quality is also reduced. These detrimental effects are neutralised when AA is added from day 0 to day 3 of embryo development. These results suggest that some of the AA metabolites, synthesised during in vitro culture, are beneficial to early embryos, although the same metabolites may have a detrimental effect on later stages of embryo development.




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3º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, Porto, 6-8 Jul/2001
EFEITO DA PMSG E DE UM ANTAGONISTA DA PROGESTERONA SOBRE A ACTIVIDADE MIOELÉCTRICA UTERINA EM OVINOS

S.C. Gonçalves, A.E.M. Horta, C.C. Marques, M.I. Vasques
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional-INIA, 2000-763 Vale de Santarém


RESUMO

A fertilização em ovelhas superovuladas com PMSG apresenta uma grande variação entre tratamentos, resultante da produção de progesterona (P4) folicular na fase éstrica e consequente falta de sincronização das ovulações. A administração de antagonistas da progesterona, consegue sincronizar as ovulações múltiplas mas conduz à ausência de fertilização devido à não progressão dos espermatozóides, que ficam retidos no cérvix. Pretendeu-se neste trabalho, verificar o efeito da PMSG e do antagonista da P4 Onapristone (ZK) sobre a actividade mioeléctrica uterina (EMG) durante a fase éstrica. Uma ovelha de raça Merino foi submetida a cirurgia para implantação de 3 pares de eléctrodos no miométrio, localizados no corpo (canal 7, CUT), na zona média (canal 5, CM) e proximal (canal 3, CP) do corno uterino. Os eléctrodos foram conectados a um sistema modular computorizado (Lablink V, Coulbourn Instruments), que permitiu fazer o registo da EMG. Durante ciclos sincronizados instituíram-se os seguintes tratamentos: PMSG (1500 UI, i.m., 24h antes da remoção da esponja) e PMSG + ZK (ZK, 1 mg kg-1, i.v., às 0 h e de 12/12 h após a remoção da esponja, durante 48 h). As sessões de registo EMG com a duração de 30 minutos foram efectuadas no momento da remoção da esponja e 24, 28, 48 e 72 horas depois. Registou-se a intensidade (distribuição de registos por 13 classes de 0 a >1 Volt) e o sentido da EMG, que foram comparados entre si e com o grupo testemunha (uma leitura durante a fase folicular não tratada).
A PMSG provoca um aumento significativo da EMG nos três canais em relação à testemunha. Este aumento é mais marcado ao nível do CM e do CUT. Relativamente ao grupo PMSGZK, verifica-se o mesmo padrão de actividade, relativamente à testemunha. No CP o PMSGZK mostra uma actividade significativamente superior à PMSG às 0 horas, mantendo esta tendência nas restantes leituras. No CM, o PMSGZK é significativamente superior à PMSG às 0 e 24 h, mostrando actividade idêntica daí em diante. No CUT, às 0 e 24 h, a EMG da PMSG é superior à do PMSGZK, invertendo-se a situação às 48 e 72 h. O grupo PMSGZK, relativamente ao grupo PMSG, apresentou significativamente mais contracções coordenadas nos três canais, no sentido posterior que anterior (66,7% and 33,3% vs. 43,8% and 56,2%, respectivamente; P< 0,04).
Os resultados mostram que a administração de Onapristone conduz a alterações quantitativas e qualitativas da actividade mioeléctrica uterina que podem explicar a ausência de fertilização por não progressão espermática, detectada em trabalhos anteriores.



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3rd Iberian Congress on Animal Reproduction, Porto, 6-8 Jul/2001
EFFECT OF PMSG AND OF A PROGESTERONE ANTAGONIST ON UTERINE ELECTROMIOGRAPHIC ACTIVITY IN SHEEP

S.C. Gonçalves, A.E.M. Horta, C.C. Marques, M.I. Vasques
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional-INIA, 2000-763 Vale de Santarém

SUMMARY

Fertilisation rates show a high variability due to different follicular progesterone (P4) production and asynchronous ovulations in PMSG superovulated ewes. Progesterone antagonists are able to synchronize multiple ovulations but impair fertilisation due spermatozoa arrest at the cervix. The purpose of this experiment was to study the effect of PMSG and P4 antagonist Onapristone (ZK) on uterine electromiographic activity (EMG) during oestrus. Three pairs of electrodes were surgically implanted into the myometrium of one Merino ewe, at the uterine body (channel 7, CUT), the medium uterine horn (channel 5, CM) and proximal uterine horn (channel 3, CP). Electrodes were connected to a computerising modular system (Lablink V, Coulbourn Instruments), which allowed EMG recordings. During synchronized cycles, the following treatments were performed: PMSG (1500 UI, i.m., 24 h before sponge withdrawal) and PMSG+ZK (ZK, 1 mg kg-1, i.v., at 0h and every 12 hours after sponge withdrawal, during 48 hours). Each EMG recording session lasted 30 minutes and was carried out at sponge withdrawal and 24, 28, 48 and 72 hours later. Intensity (recordings were distributed into 13 classes ranging from 0 to > 1 volt) and direction of EMG were compared among different groups including the control group (recorded at the follicular phase of a non treated cycle).
PMSG induces a significant increase in EMG monitored on three channels when compared to control group. This increase is even higher at the CM and CUT. PMSGZK group presents the same pattern of activity when compared to control. PMSGZK induced a significantly higher activity than PMSG in the CP at 0 hours, which was maintained afterwards. PMSGZK is significantly higher than PMSG at 0 and 24 hours in the CM, showing an identical activity from 24 hours onwards. In the CUT, PMSG treatment showed a higher EMG activity than PMSGZK from 0 to 24 hours, this pattern being reversed from 48 to 72 hours. On the three channels PMSGZK group presented a significantly more synchronized EMG with a posterior direction compared to the anterior direction presented by PMSG group (66.7% and 33.3% vs. 43.8% and 56.2%, respectively; P< 0.04).
These results suggest that sperm arrest in the cervix conducting to a lack in fertilisation following Onapristone treatment (found previously), is due to quantitative and qualitative modifications on EMG induced by the drug.




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3º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, Porto, 6-8 Jul/2001
EFEITO DA PGE2 E DA INIBIÇÃO DA SÍNTESE DE PROSTAGLANDINAS NO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO BOVINO IN VITRO.

R.M. Pereira, C.C. Marques, M.C. Baptista; M.I. Vasques e A.E.M. Horta.
Estação Zootécnica Nacional - INIA, Departamento de Fisiologia e Reprodução Animal, 2000 Vale de Santarém.

RESUMO

Pretendeu-se testar a influência da PGE2 ou da ausência de prostaglandinas (PG) no desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro em co-cultura com monocamadas de células da granulosa. A PGE2 (1,4 x 10-7 M) e a indometacina (28 µM) foram adicionadas ao meio de cultura utilizado para refrescar células e embriões. Vinte e duas horas após a inseminação, os oócitos foram divididos em 3 grupos (Testemunha, n=461; Indometacina, n=452; PGE2, n=465; 10 réplicas) e colocados nas monocamadas, prosseguindo o seu desenvolvimento até aos 12-13 dias de idade.
Os resultados mostram que a PGE2 aumenta a taxa de clivagem em 6% (P=0,04) e a qualidade dos embriões em D8, em relação à testemunha. O grupo PGE2 apresenta uma diminuição da taxa de embriões entre D7 e D8, parecendo haver nestes dias uma interferência negativa desta PG na transição de jovem blastócito para blastócito. Embora a indometacina não afecte significativamente a taxa de clivagem, neste grupo, a taxa de embriões em D7 é inferior à do grupo PGE2 (34 vs. 42,4%, P=0,03) e, em D8, à do grupo testemunha (33,1 vs. 39,9%, P=0,07). A indometacina prejudica a qualidade dos embriões em D8, com significativamente menos embriões de grau 1 que os grupos testemunha e PGE2 (P=0,007 e P=0,005) e, mais de grau 4 que o grupo PGE2 (P=0,001). Prejudica também a taxa de embriões extrusados em relação à testemunha e ao grupo PGE2 (53,21 vs. 74,02% 78,03% para P=0,001 e P<0,001). A indometacina interfere ainda na dinâmica do desenvolvimento embrionário, tendendo os embriões deste grupo a estarem atrasados em relação aos outros, sobretudo devido à acção negativa deste inibidor na eclosão dos embriões da zona pelúcida.
Os efeitos prejudiciais induzidos pelo bloqueio da síntese de prostaglandinas apontam para a importância destas hormonas nos diferentes estadios do desenvolvimento embrionário precoce. A PGE2 beneficia a clivagem e o desenvolvimento dos embriões até D7. Esta prostaglandina parece anular o efeito negativo da blastulação precoce característica dos embriões produzidos in vitro, atrasando a transição do estadio de mórula para blastócito em D7 e D8. Este atraso aparece associado a uma melhoria significativa da qualidade dos embriões.



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3rd Iberian Congress on Animal Reproduction, Porto, 6-8 Jul/2001
EFFECT OF PGE2 AND PROSTAGLANDIN SYNTHESIS INHIBITION ON BOVINE EMBRYO DEVELOPMENT

R.M. Pereira, C.C. Marques, M.C. Baptista; M.I. Vasques e A.E.M. Horta.
Estação Zootécnica Nacional - INIA, Departamento de Fisiologia e Reprodução Animal, 2000 Vale de Santarém.

SUMMARY

It was evaluated the effect of PGE2 supplementation or PG inhibition on bovine in vitro embryo development in a granulosa cell monolayers co-culture system. PGE2 (1.4 x 10-7 M) or indomethacin (28 µM) were added to culture medium used to refresh embryos and granulosa cells. Twenty two hours after in vitro insemination, ova were randomly allotted into three groups (Control, n=461; Indomethacin, n=452; PGE2, n=465; 10 trials) and transferred to granulosa cell monolayers until day 12 or 13 of embryo development.
Results show that PGE2 improved 6% in cleavage rate (P=0,004) and also embryo quality at day 8 (D8), when compared to Control. Embryo production rate decreased from D7 to D8 in PGE2 group, suggesting that at this stage PGE2 negatively affects embryo growth from young blastocyst to blastocyst. Indomethacin had no significant effect on cleavage rate, but embryo rate in this group is lower than in PGE2 at D7 (34 vs. 42.2%, P=0,03) and lower than in Control at D8 (33.1 vs. 39.9%, P=0,07). Indomethacin had a detrimental effect on embryo quality at D8, as significantly less grade 1 embryos than in Control and PGE2 groups (P=0.007 and P=0.005) and more grade 4 embryos than in group PGE2 were produced (P=0,001). Indomethacin had also a detrimental effect on hatched embryo rate when compared to Control and PGE2 groups (53.21 vs. 74.02% and 78.03%, P=0.001 and P<0.001). Embryos produced in Indomethacin group are prone to be retarded when compared to embryos from other groups, due to its negative effect on the mechanism of embryo hatching.
Detrimental effects induced by prostaglandin synthesis inhibition indicate that these hormones play an important role in all stages of embryo development. PGE2 improves cleavage and embryo development until day 7 and delays embryo growth from morula to blastocyst stage. The usually accelerated transition from morula to blastocyst affecting embryo viability could benefit of this PGE2 effect associated to a significant improvement in embryo quality.




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3º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, Porto, 6-8 Jul/2001
TESTE DE ENDOSMOSE (HOST) EM SÉMEN DE CAPRINOS DA RAÇA SERRANA

G.M.B.C. Ferreira, J.P.F. Sousa, J.P. Barbas, e A.E.M. Horta
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional – INIA, 2000 Vale de Santarém

RESUMO

O sémen de quatro bodes da raça Serrana foi colhido quinzenalmente durante 22 meses através de vagina artificial para avaliação de todas as características seminais, cujos resultados completos foram apresentados noutra publicação. Neste trabalho apresentam-se os resultados da reacção endosmótica seminal a uma solução hipoosmótica de 100 mOsm/Kg, efectuada aos 5 e 25 minutos de incubação e traduzida na percentagem de espermatozóides (spz) com reacção positiva total ou parcial, durante 12 meses (n=195).
No total de colheitas efectuadas, a percentagem de spz com reacção positiva aos 25 minutos foi significativamente superior à dos 5 minutos de incubação (88,5% vs. 85,9%). Houve uma correlação significativa e positiva entre os valores lidos aos 5 e 25 minutos (r=0,49, P<0,05). A percentagem de spz reagindo positivamente ao teste, apresentou diferenças significativas entre animais, destacando-se os valores mínimos de 81,38% e 85,96% e máximos de 90,35% e 90,96%, respectivamente aos 5’ e 25’. Não se observaram diferenças significativas entre meses e entre estações do ano para as endosmoses aos 5 minutos ou aos 25 minutos. A percentagem de endosmoses positivas, em qualquer dos tempos de medição, apresentou correlações significativas e negativas com a mobilidade individual (r=-0,17 e r=-0,18) e positivas com a percentagem de spz normais (r=0,15 e r=0,21), respectivamente aos 5 e 25 minutos. Destaca-se a correlação significativamente negativa entre as endosmoses e a percentagem de spz com anomalias da cauda. (r=-0,18, e r=-0,21, respectivamente aos 5’ e 25’). As correlações verificadas entre a proporção de endosmoses positivas e os três parâmetros seminais qualitativos referidos deveram-se sobretudo a dois bodes, que registaram valores de correlação elevados para qualquer dos casos referidos. É ainda de referir que um dos bodes não apresentou correlações significativas para nenhum dos casos relatados. Para além das referidas, não foram observadas correlações significativas entre as endosmoses e quaisquer outras características seminais (volume, mobilidade massal, concentração espermática, spz vivos, anomalias da cabeça e da peça intermediária e integridade do acrossoma). De igual modo, não foram encontradas correlações significativas (P>0,05) entre as endosmoses e as variáveis ambientais como o fotoperíodo (r=-0,06), e as temperaturas média (r=0,07) e máxima (r=0,09) diárias.
Ficou patente a inexistência de variações sazonárias da percentagem de endosmoses positivas, sendo evidente uma forte variação entre indivíduos que condicionam o aparecimento de correlações com outras características seminais.



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3rd Iberian Congress on Animal Reproduction, Porto, 6-8 Jul/2001
BUCK SEMEN HOS TEST OF SERRANA BREED

G.M.B.C. Ferreira, J.P.F. Sousa, J.P. Barbas, e A.E.M. Horta
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional – INIA, 2000 Vale de Santarém

SUMMARY

The semen of adult 4 bucks o the Serrana breed was collected every 15 days during 22 months to evaluate all seminal parameters and complete results were published elsewhere. This work reports results during 12 months (195 ejaculates) on the semen HOST test with an hypoosmotic solution of 100 mOsm/Kg, incubated for 5’ and 25’ and expressed as the percentage of sperm with partial or total endosmotic reaction.
In overall ejaculates, the percentage of sperm with positive reaction was significantly higher at 25’ than at 5’ of incubation (88.5% vs. 85.9%). There was a significant and positive correlation between values from 5’ and 25’ (r=0.49, P<0.05). The percentage of sperm positively reacting to the HOS test, presented significant differences between animals, the lower levels being 81.38% e 85.96% and the higher ones 90.35% e 90.96% at 5’ and 25’, respectively. There were no significant differences between months and season of the year either at 5’ or 25’ of incubation. The percentage of positive endosmosis at 5’ and 25’, were significantly and negatively correlated with individual sperm motility (r=-0.17 e r=-0.18, respectively) and positively correlated with normal sperm rate (r=0.15 e r=0.21, respectively). It is highlighted the significantly negative correlation between positive endosmosis at 5’ and 25’ and the rate of tail abnormalities (r=-0.18, e r=-0.21, respectively). All these correlations were mainly due to 2 of the bucks presenting a high relationship. One of the males did not present significant correlations with any of the studied variables. There were no significant correlations with any of the other seminal parameters measured (volume, sperm concentration, live sperm, head and mid piece abnormalities and acrosome integrity). Also, there were no significant correlations between positive endosmosis and environmental variables such as photoperiod, medium and maximum daily temperatures (P>0.05).
We may conclude that endosmotic sperm reaction in this breed is not affected by seasonal factors and that the individual male effect influences the appearance of significant correlations with other seminal parameters.




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3º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, Porto, 6-8 Jul/2001
EFEITO DAS PROSTAGLANDINAS SOBRE A FERTILIZAÇÃO IN VITRO NOS BOVINOS

C.C. Marques, M.C. Baptista, R.M. Pereira, M.I. Vasques, A.E.M. Horta
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional -INIA, 2000-763 Vale de Santarém

RESUMO

As prostaglandinas (PG) parecem estar envolvidas nas várias fases de maturação dos oócitos e spz, influenciando assim o posterior processo de fertilização e desenvolvimento embrionário. Pretendeu-se determinar o efeito da suplementação do meio de fertilização, (FERT) com um inibidor de síntese das prostaglandinas (indometazina - Indo) e PGF2α, PGE2 e PGE1, sobre a clivagem, qualidade, viabilidade e desenvolvimento embrionário. Na exp.1 (10 sessões, 1204 oócitos) o meio FERT (TALP + Heparina + PHE) foi suplementado com PGF2α, constituindo-se os seguintes grupos: Testemunha; Indo (2,8 x 10-5 M), PGF2α (1,4 x 10-7 M) e Indo+PGF2α (2,8 x 10-5 M + 1,4 x 10-7 M). Na exp.2 (10 sessões, 1247 oócitos) e exp.3 (9 sessões, 1281 oócitos) realizaram-se os mesmos tratamentos, substituindo-se a PGF2α por PGE2 (exp.2) e PGE1 (exp.3). Na fertilização utilizou-se sémen descongelado, processado pelo método do swim-up (TALP s/Ca com cafeína) durante 1 hora, sendo utilizada uma concentração final de 1x106 spz/mL. Após 22 horas de incubação os oócitos inseminados foram transferidos para um sistema de co-cultura com células da granulosa (TCM 199 + 10% soro de vaca superovulada) e às 48 horas avaliou-se a clivagem, tendo-se acompanhado o desenvolvimento embrionário até à fase de extrusão. A qualidade dos embriões foi avaliada ao 8º dia de desenvolvimento utilizando uma escala que variou de grau 1 (muito bom) a grau 4 (mau).
Em todas as experiências, a inibição da síntese das PG (Indo) reduziu significativamente a taxa de fertilização relativamente ao grupo testemunha (menos 14,8%; 8,3% e 7,6%, respectivamente nas experiências 1-3; P<0,05). A PGF2α, isoladamente ou em associação com a Indo, não foi capaz de inverter o efeito negativo da Indo sobre a taxa de fertilização, relativamente ao grupo testemunha (58,3% e 56,4% vs. 67,8% respectivamente; P<0,05 ). A PGE2, na ausência ou presença de outras PG (Indo+PGE2 e PGE2), conseguiu inverter o efeito negativo da indometazina sobre a clivagem observada no grupo testemunha (56,0% e 52,2% vs. 59,1%, respectivamente; P>0,05). A PGE1 só conseguiu esta inversão do efeito negativo da indometazina, na ausência de outras PG (PGE1+Indo: 51,6% vs. 55,3%; P>0,05). Quando na presença de outras PG, a PGE1 não conseguiu aproximar a taxa de clivagem à do grupo testemunha (PGE1: 47,2% vs. 55,3%; P<0,04), sugerindo que a sua acção sobre este mecanismo depende de outras PGs. Relativamente ao desenvolvimento embrionário verificou-se que as diferenças significativas entre os tratamentos para os diferentes estadios de desenvolvimento nos dias 7 e 8 anulam-se relativamente ao atraso ou avanço do crescimento embrionário dos diferentes grupos para os dias 9 e 10. A inibição da síntese das PG no meio FERT prejudicou a qualidade dos embriões ao 8º dia de desenvolvimento, salientando-se a acção da PGE2 que melhorou significativamente a qualidade dos embriões relativamente ao grupo testemunha.
Estes resultados evidenciam um papel determinante de algumas prostaglandinas sobre a fertilização e qualidade dos embriões, identificando-se a PGE2 e a PGE1 com um papel positivo, embora esta última na dependência de outras PG.



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3rd Iberian Congress on Animal Reproduction, Porto, 6-8 Jul/2001
EFFECT OF PROSTAGLANDINS ON IN VITRO FERTILISATION OF BOVINE OOCYTES

C.C. Marques, M.C. Baptista, R.M. Pereira, M.I. Vasques, A.E.M. Horta
Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional -INIA, 2000-763 Vale de Santarém

SUMMARY

Prostaglandins (PG) have been reported to be involved in different stages of oocyte and sperm maturation, affecting subsequent fertilisation and embryo development. The purpose of this study was to determine the effect of a PG synthesis inhibitor (indomethacin, Indo) and of PGF2α, PGE2 and PGE1 added to the fertilisation medium (FERT), on cleavage and embryo development rates and on embryo quality at Day 8 (D8) of culture. In experiment 1 (Exp. 1, 10 trials, 1204 oocytes), PGF2α was added to FERT (TALP+heparin+PHE) according to the following treatments: Control (C); indomethacin (Indo, 2.8x10-5 M); PGF2α (1.4x10-7 M) and Indo (2.8x10-5 M) + PGF2α (1.4x10-7 M). In experiment 2 (Exp. 2, 10 trials, 1247 oocytes) and in exp. 3 (Exp. 3, 9 trials, 1281 oocytes) PGF2α was replaced by PGE2 (Exp.2) and by PGE1 (Exp.3), following the same treatments as described above. Bovine thawed semen was processed by swim-up for 1 hour in calcium-free TALP medium with caffeine. A final sperm concentration of 1x106 sperm/mL was used for insemination. After 22 hours of incubation, embryos were transferred to a granulosa cell co-culture system (1x106 cells/mL of TCM199 + 10% oestrus superovulated cow serum). Embryos were evaluated for cleavage by 48 hours after insemination and throughout development from D8 until the hatched blastocyst stage. Embryo quality was also assessed at D8 and embryos were classified from grade1 (very good) to grade 4 (poor).
Results show that prostaglandin inhibition significantly reduced fertilisation rates in all experiments (14.8%, 8.3% and 7.6% less in Indo groups, from experiments 1 to 3, respectively, than in control group, P<0.05). PGF2α was unable to reverse the negative effect of indomethacin on fertilisation rates (58.3% and 56.4%, in PGF2α and Indo+PGF2α groups, respectively, vs 67.8% in control group; P<0.05). PGE2 could reverse that effect, either in the presence of other prostaglandins or alone (52.2% and 56.0% in PGE2 and Indo+PGE2 groups, respectively, vs. 59.1% in control; P>0.05). PGE1 could only reverse that negative effect in Indo+PGE1 group (51.6% vs 55.3% in control; P>0,05). When other prostaglandins were present, PGE1 could not reach the control group fertilisation rates (PGE1=47.2% vs Control=55.3%; P<0.04), suggesting that its effect on fertilisation depends on the presence of other PGs. Significant differences among treatments on different stages of embryo development by D7 and D8 disappeared through a delay or a progress in embryo development by D9 and D10 for the same treatments. PG synthesis inhibitor added to the fertilisation medium had a detrimental effect on D8 embryo quality, while PGE2 significantly improved quality when compared to the control group.
These results indicate that some PG have an essential role on embryo fertilisation and quality, such as PGE2 and PGE1, which showed a positive effect on these mechanisms, although PGE1 effect depends on the presence of other PG.


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Jornadas de Bovinicultura, IAAS-UTAD, Vila Real, 22-23 Dez/2001
DISTÚRBIOS REPRODUTIVOS EM BOVINOS

António E. M. Horta
Med. Vet. - Investigador Coordenador
Departamento de Reprodução Animal, E.Z.N. – I.N.I.A.
2000 Vale de Santarém
http://aemhorta.tripod.com/

Resumo

O clínico da reprodução em explorações bovinas leiteiras tem uma acção fundamental no diagnóstico e resolução dos problemas de infertilidade. Paralelamente à sua acção, o maneio da exploração, englobando a alimentação, alojamento, registos e períodos de observação dos animais, são peças chave para manter um bom desempenho reprodutivo das explorações.
Logo na recria das novilhas se pode fazer sentir a acção do criador, ao permitir que a puberdade aconteça no momento óptimo, através de uma alimentação equilibrada. Se houver de carências alimentares o primeiro cio poderá surgir muito depois dos 12 meses de idade, comprometendo-se assim o objectivo económico das novilhas parirem aos dois anos de idade.
No final da gestação é fundamental haver cuidados especiais quanto à higiéne e alimentação - quer do ponto de vista energético como do equilíbrio em Ca/P e outros microelementos (Se, Mg), - contribuíndo no seu conjunto para a prevenção de problemas de contractilidade uterina, expulsão/separação da placenta, prevenção de metrites puerperais, atrasos na involução uterina e no reinício da actividade ovárica.
A observação das vacas no pós-parto pelo clínico da reprodução, permite detectar atempadamente problemas de anestro (ovários quiescentes), outros distúrbios ao nível ovárico (quistos foliculares ou luteínicos) ou uterino (metrites, endometrites) e ovulações silenciosas (ligadas ao próprio animal ou a maneio deficiente).
O sistema de detecção de cios e a inseminação artificial efectuada em tempo óptimo e segundo os requisitos técnicos, são instrumentos fundamentais para um bom desempenho reprodutivo dos animais, podendo conduzir a verdadeiros desastres económicos quando não implementados de acordo com os procedimentos técnicos conhecidos. A inobservância dos animais em períodos de acalmia (2 vezes/dia ou mais), a qualidade do piso da exploração e a incidência de doenças podais são as principais causas de cios não observados.
O diagnóstico de gestação por ecografia, doseamentos hormonais e palpação rectal, são práticas que se complementam no sentido do diagnóstico precoce das vacas não gestantes e da sua recuperação o mais rapidamente possível. É assim possível saber se estamos em presença de algum problema de origem alimentar, infeccioso ou orgânico que esteja na base da infertilidade observada.
Nos bovinos de carne em extensivo, o desempenho da reprodução pode ser afectado pela estação do ano/alimentação e por épocas limitadas de cobrição com ausência de diagnóstico de gestação. Com efeito, longos períodos de anestro pós-parto com origem numa deficiente alimentação durante a gestação, não se compadecem com períodos restritos de cobrição subsequentes. Pode haver perdas elevadas se não se diagnosticarem as fêmeas não gestantes após cada época de cobrição instituída e permitir a sua recuperação ou eliminação.


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