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Fórum - Ética e Investigação em Medicina, Resumos de Comunicações, Ordem dos Médicos, 31/Out/1997
APLICAÇÃO PRÁTICA DA CLONAGEM EM MEDICINA VETERINÁRIA

A.E.M. Horta
Estação Zootécnica Nacional, 2000 Vale de Santarém

A investigação em biotecnologia tem conhecido na última década um desenvolvimento muito rápido, permitindo já a sua aplicação em situações concretas nas áreas médicas humana e veterinária e na produção de alimentos em geral.
No âmbito das tecnologias da reprodução em animais domésticos salienta-se o avanço na produção total de embriões in vitro (maturação do oócito, fertilização e desenvolvimento embrionário até à fase de blastocito), a sexagem do embrião (por biópsia de DNA/PCR ou por separação fluorocitométrica dos spz X e Y), a colheita de oócitos por via transvaginal (OPU - ovum pick-up), e a clonagem (por bisecção embrionária ou por microinjecção de núcleos de células da linha embrionária ou somáticas). A associação das técnicas avançadas de reprodução com a de transferência de genes, tem permitido desenvolver animais quiméricos (portadores de genes estranhos) que podem servir variados objectivos (produção de proteínas humanas, células tecidos e órgãos imunotolerantes passíveis de serem transplantados para o homem).
Por outro lado, ao nível da cultura de linhas celulares clonadas manipuladas genéticamente, torna-se possível a obtenção de vacinas e soros monoclonais e de proteínas e hormonas (somatotrofinas) difíceis de obter a partir de animais vivos. A cultura in vitro de células de determinados órgãos (nas quais se produziram ou não as correcções desejadas) pode constituir uma nova possibilidade para a transplantação de órgãos (pâncreas, pele etc.) e para a cura de inúmeras doenças no ser humano e nos animais (tumores, doenças cardio-vasculares, doenças nervosas) pela via somática.
Na produção animal, será possível orientar as explorações com maior eficácia quer na produção de leites não reactivos (leite humanizado) e modulação de outros constituíntes do leite, quer no próprio processo de crescimento dos animais (correcção adequada do processo de crescimento no sentido de satisfação das exigências do consumidor relativamente à qualidade da carne). O controlo de determinadas doenças infecto-contagiosas (doença de Aujeszky, IBR-IPV, BVD-MD, Brucelose etc..) está já a beneficiar da produção de vacinas monoclonais com proteínas de marcação, que permitem diferenciar animais portadores de anticorpos vacinais dos portadores de anticorpos originados pelo agente da doença.
O recente trabalho de Wilmut et al. (1997), porque permite produzir animais clonados de uma forma completamente assexuada a partir de células somáticas, trouxe à ribalta uma discussão adiada sobre a utilização futura dos conhecimentos emergentes da caracterização do genoma humano. As potenciais vantagens inconvenientes e riscos da aplicação desta tecnologia serão sem dúvida motivo de discussão neste fórum.

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Proceedings of the 13th Scientific Meeting of A.E.T.E., Lyon, 12-13 Sept, p. 172, 1997
EFFECT OF PROGESTERONE SUPPLEMENTATION ON PREGNANCY MAINTENANCE AFTER TRANSFER OF IN VITRO PRODUCED EMBRYOS IN CATTLE

Lopes da Costa, L.F., Quaresma, M., Horta, A.E.M.(a), Robalo Silva, J.

Faculdade de Medicina Veterinária de Lisboa, R Gomes Freire 1199 Lisboa Codex
(a) Estação Zootécnica Nacional, 2000 Vale de Santarém

Summary
Suckled beef cows (n = 87) were treated with the Crestar (Intervet) method plus 500 UI PMSG at the of implant removal (9 days in situ). Cows observed in standing estrus (D0) were allocated at random to three groups: AI - Artificial insemination with frozen Charolais semen; M+TE - inseminated cows received an in vitro produced (IVP) embryo in the contralateral horn of the corpus luteum (CL); 2 ET - cows received 2 IVP embryos (ipsi and contralateral horns of the CL). Transfers were done on D7. Embryos were produced from oocytes aspirated from slaughterhouse ovaries (Friesian cows and heifers), matured, fertilized (with Charolais semen) and cultured (granulosa cells co-culture) in vitro. Grade I blastocysts were frozen in 1.5M ethylene glycol plus 0.lM sucrose in PBS + FCS and thawed in a 25°C water bath, followed by direct transfer. On D7 cows in each group were allocated at random to a control and a treatment group. Treatment consisted in an ear implant containing 3 mg norgestomet (Crestar, Intervet) left in situ until D22. Plasma progesterone (P4) was measured on D0, D7 and D22. Cows that did not respond to estrus synchronization (no estrs observed, no CL on D7 or with P4 values either high on D0 or low, on D7) were excluded. Cows vith P4 < 0.5 ng/ml (D0), > 1.0 ng/ml (D7) and > 2.0 ng/ml (D22) were considered as pregnant. Afler D22 cows were left on pasture until calving. Data were analysed by Chi square.
As shown in Table I, presumed high pregnancy rates were obtained on D22 in the three groups, irrespective of progestagen supplementation. There was a tendency for calving rates to be higher in norgestomet supplemented cows of AI + ET and 2 ET groups due to lower pregnancy losses (p < 0.05) while in AI cows there was no apparent benefit in supplementation. Calving rates for IVP frozen embryos were similar to AI in cows supplemented but not in control cows, showing lower viability of IVP frozen embryos. In the AI + ET group the IVP embryo apparently induced pregnancy interruption which could be partially overcomed by the supplementation. In this group only one IVP calf was born (supplemented group). These results suggest that progestagen supplementation may be used to maintain pregnancy, after transfer of frozen IVP embryos.

Table I : Effect of progestagen supplementation on calving rates and pregnancy losses of IVP frozen embryos
Group Treatment n Presumed
pregnant (D22)		 Calving Pregnancy
losses
AI control
P4 suppl.		 11
10		 9(81.8%)
7(70.0%)		 7(63.6%)
5(50.0%)		 2(22.2%)
2(28.6%)
AI+ET control
P4 suppl.		 9
9		 8(88.9%)
8(88.9%)		 1(11.1%)
5(55.6%)		 7(87.5%)a
3(37.5%)c
2 ET control
P4 suppl.		 11
10		 8(72.7%)
7(70.0%)		 4(36.4%)
5(50.0%)		 4(50.0%)b
2(28.6%)d
a+b vs c+d p < 0.05
Research supported by PRAXIS 3/3.2/AGR/01/94 and CIISA

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Proceedings of the VIII Congress of Animal Production, "Management welfare and Animal Production", Angra do Heroísmo – Azores, 5-7 Nov. 1998, pag. 49.
Large calf syndrome associated to the transfer of in vitro produced embryos.

A.E.M. Horta
Estação Zootécnica Nacional-INIA, 2000 Vale de Santarém


Abstract

The birth of calves weighting significantly above the average, associated to the technique of in vitro embryo production (IVP) is reviewed. From recent published papers on ovine and bovine we can now conclude to exist a direct influence of the IVP technique on fetal intrauterine growth during pregnancy and on birthweight. However, not all results are coincident concerning the degree of deviation from normal parameters. If the first published data could not separate the effects of genotype and the IVP technique, more recent publications clearly show that an interaction between both effects seems to exist. In breeds with heavier adult animals and in uncontroled beef crossed animals we may find average increases on calf birthweights above 9 kg, while in smaler adult bovine breeds the increase in birthweight provoked by the IVP technique is lower than 2 kg in average. On the practical point of view this is an important information because dystocia and calf survival early after birth, which are positively correlated, are both influenced by birthweight

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Livro de Resumos do VIII Congresso de Zootecnia, "Maneio Bem Estar e Produção Animal", Angra do Heroísmo – Açores, 5-7 Nov 1998, pag. 49.
Síndrome de vitelos grandes associado à transferência de embriões produzidos in vitro.

A.E.M. Horta
Estação Zootécnica Nacional-INIA, 2000 Vale de Santarém


Resumo

É analisada a ocorrência do nascimento de vitelos significativamente mais pesados do que a média, associada à técnica de produção in vitro de embriões (IVP). Dos trabalhos publicados em bovinos e ovinos pode-se inferir que existe influência da técnica IVP sobre o crescimento do feto durante a gestação e consequente peso ao nascimento. Contudo, nem todos os resultados são coincidentes relativamente à quantificação do problema em termos de desvio à normalidade. Se os primeiros trabalhos não conseguiram separar o efeito do genótipo da técnica, trabalhos mais recentes levam-nos a concluir que parece existir uma interacção entre aqueles dois factores. Assim, nas raças grandes e nos cruzamentos indiscriminados em bovinos, podem aparecer desvios à média superiores a 9 kg, enquanto que em raças pequenas esse desvio se situa à volta de 2 kg. Em termos práticos esta informação é importante visto que as distócias e a sobrevivência dos recém-nascidos, além de estarem altamente correlacionadas entre si, são ambas influenciadas pelo peso ao parto.
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Programa de Investigação para obtenção do grau de Habilitação Científica, INIA, 1999
SENSIBILIDADE DE RAÇAS NACIONAIS BOVINAS AO SÍNDROMA DE VITELOS PESADOS ASSOCIADO À PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN VITRO.

A.E.M. Horta
Departamento de Fisiologia e Reprodução Animal, EZN-INIA
2000 Vale de Santarém

Resumo
É analisada a ocorrência do nascimento de vitelos significativamente mais pesados do que a média, associada à técnica de produção in vitro de embriões (IVP). Dos trabalhos publicados em bovinos e ovinos pode-se inferir que existe influência da técnica IVP sobre o crescimento do feto durante a gestação e consequente peso ao nascimento. Contudo, nem todos os resultados são coincidentes relativamente à quantificação do problema em termos de desvio à normalidade. Se os primeiros trabalhos não conseguiram separar o efeito do genótipo do da técnica, trabalhos mais recentes levam-nos a concluir que parece existir uma interacção entre aqueles dois factores. Assim, nas raças grandes e nos cruzamentos indiscriminados em bovinos, podem aparecer desvios à média superiores a 9 kg, enquanto que em raças pequenas esse desvio se situa à volta de 2 kg. Em termos práticos esta informação é importante visto que as distócias e a sobrevivência dos recém-nascidos, além de estarem altamente correlacionadas entre si, são ambas influenciadas pelo peso do vitelo ao parto.
Face aos conhecimentos existentes, propõe-se um programa de investigação visando contribuir para a compreensão do processo, possíveis causas e factores a ele associados. A ausência de estudos que caracterizem e avaliem os riscos da transferência de embriões produzidos in vitro, pode pôr em causa a expansão da utilização desta técnica pelo seu alto grau de imprevisibilidade relativamente à sobrevivência das mães e recém-nascidos.
Neste programa prevêem-se acções que identifiquem factores que durante as várias etapas de produção in vitro possam estimular precocemente o desenvolvimento do embrião e do feto durante a gestação. Entre eles é proposto o estudo da influência da progesterona no crescimento embrionário precoce, a caracterização deste efeito em duas raças nacionais e a sua relação com alterações hormonais e crescimento fetal ocorridos durante a gestação, dificuldades ao parto e crescimento dos vitelos. Propõe-se igualmente estudar a sensibilidade das raças Mertolenga e Alentejana ao síndroma dos vitelos pesados usando embriões IVP.

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IX Congresso de Zootecnia, "A Zootecnia no 3º Milénio", Porto, 11-13 Nov 1999, Resumos, pag. 133.
EFEITO DE DUAS DOSES DE PMSG EM OVELHAS SERRA DA ESTRELA SUBMETIDAS A DUPLA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL SOBRE A FERTILIDADE, PROLIFICIDADE E FECUNDIDADE.

J. Barbas, R. Mascarenhas, C. Baptista e A.E.M. Horta
Departamento de Fisiologia e Reprodução Animal, EZN-INIA
2000 Vale de Santarem

Resumo
A ovelha raça Serra da Estrela pertencente ao grupo Bordaleiro é a melhor raça leiteira Nacional. Apresenta uma boa capacidade reprodutiva e tem a possibilidade de se reproduzir todo o ano. Normalmente são efectuadas duas épocas de cobrição,uma principal na Primavera e uma suplementar no Outono. Neste trabalho pretendeu-se avaliar-se a influência de 250 ou 500 UI de Pregnant Mare Serum Gonadotrophin PMSG), administrada durante o tratamento de sincronização, sobre vários parâmetros reprodutivos. Foram sincronizadas 27 ovelhas multíparas em Outubro com esponjas vaginais de 40 mg de FGA (acetato de fluorogestona) durante 12 dias e no momento da retirada das esponjas vaginais foram administradas 250 UI (n=8) ou 500 UI (n=19) de PMSG. Cerca de 24 horas após a remoção das esponjas vaginais começaram a ser realizadas detecções sistemáticas do estro a todas as ovelhas, a intervalos de 4 horas, e durante um período aproximado de 56 horas a partir do 1° estro detectado, foram efectuadas colheitas de sangue com o mesmo intervalo para detecção do pico de LH. A hormona luteinizante (LH) foi doseada no plasma ovino utilizando um teste imunoenzimàtico de tipo "ELISA sandwich".
O intervalo médio remoção da esponja vaginal-início do estro (Rev-Estro) foi de 36,94±2,68 horas, não havendo diferenças significativas entre grupos. O intervalo médio remoção da esponja vaginal-pico de LH (Rev-LH) (n=20) foi de 45,35±7,01 horas, não sendo diferente entre grupos. No grupo de 500 UI, duas ovelhas que manifestaram estro não mostraram pico de LH. A dose de PMSG não afectou os intervalos médios estro-LH (Estro-LH) e estro-lªIA (Estro-lªIA) cujas durações médias foram, respectivamente, 8,76±7,43 horas (n=20) e 12,06±5,13 horas (n=22). As IA foram efectuadas em todas as ovelhas (n=27), por via cervical utilizando sémen refrigerado (15 C°) com uma concentração de 250 milhões de espermatozóides por dose (0,25 ml). A lªIA e a 2ªIA foram efectuadas às 49,1±3,65 horas e 62,24±1,57 horas após a remocão das esponjas vaginais, sendo o intervalo médio entre as inseminações artificiais de 13,14+4,98 horas. No grupo tratado com 250 UI de PMSG a fertilidade, prolificidade e fecundidade foram respectivamente 62,5%, 140% e 87,5%. No grupo injectado com 500 UI de PMSG, os parâmetros correspondentes foram 47,37%, 144,44% e 68,42%. Não se observaram diferenças significativas entre grupos, sendo a fertilidade, prolificidade e fecundidade globais de 51,85 %, 142,86 % e 74,07 %, respectivamente.
As doses de PMSG utilizadas nas condições em que se realizou este trabalho, não influenciaram significativamente os parâmetros estudados.

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IX Congresso de Zootecnia, "A Zootecnia no 3º Milénio", Porto, 11-13 Nov 1999, Resumos (P72), pag. 136.
CARACTERIZAÇÃO DUMA CULTURA DE CÉLULAS PLACENTÁRIAS EM MONOCAMADA PARA SUPORTE DO DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO.

R. M. Pereira, C. C. Marques, M. C. Baptista, M. I. Vasques e A. E. M. Horta
Departamento de Fisiologia e Reprodução Animal, EZN-INIA
2000 Vale de Santarem

Resumo
Pretendemos avaliar a capacidade das células epiteliais trofoblásticas da placenta, cultivadas com meios de cultura com diferentes soros, para suportarem o desenvolvimento embrionário bovino in vitro.
As células placentárias foram obtidas por tripsinização de cotilédones fetais provenientes do matadouro e cultivadas em meios de cultura com FCS, FCS até Dc2 e SOCS até Dc17, ou FCS até Dc8-9 e SOCS até Dc17. Estas células foram coradas com acetolacmóide a 1% e azul tripan a 0.8% em Dc0, Dc4, Dc7, Dc10, Dc14 e Dc17 para caracterização e contagem das células. Os oócitos maturados e fertilizados in vitro foram transferidos para as monocamadas de células 22 horas após a inseminação, tendo sido realizado um 1º ensaio, com células de placenta na 1ª semana de cultura em monocamada (P1), e um 2º, com células de placenta na 2ª semana de cultura, suplementadas com SOCS a partir de Dc2 (PDc2) ou Dc8-9 (PDc8-9), sendo ambos comparados com os resultados obtidos com a co-cultura dos embriões com as células da granulosa (Gr).
A percentagem de células binucleadas presentes nas células do epitélio trofoblástico em cultura em monocamada apresentou valores médios entre 17.5% e 22.97%, valores independentes da idade do feto das placentas utilizadas, dos dias de permanência em cultura e dos diferentes soros testados nos meios de cultura. Quanto à percentagem de células viáveis verificou-se um aumento de viabilidade depois de Dc0, tendo-se obtido valores de 90.7% a 96.7% entre Dc10 e Dc17. Quanto à capacidade deste sistema de suportar o desenvolvimento embrionário verificou-se existirem piores condições de cultura dos embriões com células P1, sendo todos os valores significativamente superiores no grupo da granulosa (clivagem: Gr = 74.01% vs. P1 = 64.94%; qualidade de embriões D8 de grau 4: Gr=15.78 vs. P1 = 69.23%; embriões extrusados: Gr = 87.5% vs. P1 = 7.1%). Na 2ª semana de cultura das células placentárias, as clivagens (Gr = 67.05% vs. PDc2 = 67.66% vs. PDc8-9 = 72.42%), assim como a percentagem de embriões extrusados (Gr = 66.7% vs. PDc2 = 48.3% vs. PDc8-9 = 56%) não apresentaram diferenças significativas. Já a percentagem de embriões em D8 era signifivativamente superior e os embriões de melhor qualidade na co-cultura destes com as células da granulosa.
Estes resultados apontam para uma melhoria das condições proporcionadas aos embriões quando são cultivados com células placentárias já na 2ª semana de cultura e em meio com SOCS apenas a partir do dia 8-9 da cultura celular, sugerindo a necessidade de aperfeiçoar o sistema desenvolvido.

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IX Congresso de Zootecnia, "A Zootecnia no 3º Milénio", Porto, 11-13 Nov 1999, Resumos (P73), pag. 137.
EFEITO DO TIPO E CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS EM CO-CULTURA NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

R. M. Pereira, C. C. Marques, M. C. Baptista, M. I. Vasques e A. E. M. Horta
Departamento de Fisiologia e Reprodução Animal, EZN-INIA
2000 Vale de Santarem

Resumo
Pretendeu-se avaliar a capacidade de diferentes concentrações de células epiteliais trofoblásticas da placenta (1 x 106/ml, 5 x 105/ml e 2 x 105/ml) comparada com a das células da granulosa (1 x 106/ml) para suportarem o desenvolvimento embrionário bovino in vitro. As células placentárias foram obtidas por tripsinização de cotilédones fetais provenientes do matadouro e coradas com acetolacmóide a 1% e azul tripan a 0.4 % para caracterização e contagem das células nesse dia (dia de cultura zero - Dc0) e ao longo de 3 semanas de cultura em monocamada. Os oócitos maturados (TCM199 + 10% SOCS + ab) e fertilizados in vitro (Meio Talp + 1 x 106/spz/ml) foram transferidos para as monocamadas de células, 22 horas após a inseminação e depois da remoção da células do cumulus, em Dc8-9 das células da placenta e Dc2-3 das células da granulosa. Diferentes concentrações iniciais de células placentárias em monocamada não influenciaram a percentgem de células binucleadas ao longo do período de cultura (Dc0, Dc4, Dc7, Dc10, Dc14 e Dc17), tendo-se observado existir uma maior estabilidade e uniformidade na concentração e vitalidade de todas as células ao longo da cultura, quando a concentração inicial era de 5 x 105/ml. Quanto à capacidade de suporte do desenvolvimento embrionário por parte da células da placenta, as diferentes concentrações celulares iniciais não influenciaram significativamente as clivagens (5 x 105 = 82.9% vs. 1 x 106 = 80.8% e 5 x 105 = 79.7% vs. 2 x 105 = 79.2%), a taxa de embriões D8 (5 x 105 = 12.9% vs. 1 x 106 = 10.5% e 5 x 105 = 20.1% vs. 2 x 105 = 17.2%) nem a de embriões extrusados (5 x 105 = 61.5% vs. 1 x 106 = 55% e 5 x 105 = 21.6% vs. 2 x 105 = 25%). Estes resultados, quando comparados com os obtidos com a co-cultura dos embriões com células da granulosa, são significativamente inferiores quanto à taxa e qualidade de embriões D8 e à taxa de embriões extrusados, o que aponta para as melhores condições oferecidas pelas células da granulosa em relação às da co-cultura dos embriões com células de placenta em qualquer das concentrações estudadas.

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IX Congresso de Zootecnia, "A Zootecnia no 3º Milénio", Porto, 11-13 Nov 1999, Resumos (P74), pag. 138.
EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE OXITOCINA EM OVELHAS SERRA DA ESTRELA INSEMINADAS ARTIFICIALMENTE SOBRE A FERTILIDADE, PROLIFICIDADE E FECUNDIDADE.

J. Barbas, R. Mascarenhas, C. Baptista e A.E.M. Horta
Departamento de Fisiologia e Reprodução Animal, EZN-INIA
2000 Vale de Santarem

Resumo
A ovelha Serra da Estrela é um animal rústico estando bem adaptada aos vários sistemas de exploração a que é submetida. É a melhor raça leiteira portuguesa, sendo as produções comparáveis às de outras raças leiteiras exploradas na região mediterrânica. No aspecto reprodutivo é uma ovelha poliéstrica contínua, embora hajam períodos mais desfavoráveis para a reprodução como sejam o Inverno e o início da Primavera. Neste trabalho procurou-se avaliar a influência da administração de oxitocina antes da inseminação artificial (IA) sobre os parâmetros reprodutivos subsequentes.
Neste ensaio foi efectuada a sincronização do estro a 34 ovelhas multíparas em Junho com esponjas vaginais de 40 mg de FGA (acetato de fluorogestona) durante 12 dias e no momento da retirada das esponjas vaginais foram administradas 500 UI de PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotrophin). A oxitocina foi administrada por injecção cervical na dose de 20 UI (n=21) cerca de três horas antes da IA, a qual foi efectuada por via cervical com sémen refrigerado a 15 Cº cerca de 55,33 horas após a retirada das esponjas vaginais, utilizando uma concentração de 250 milhões de espermatozóides por dose (0,25 ml). As restantes ovelhas (n=13) não foram tratadas com oxitocina, mas submetidas ao mesmo protocolo.
No grupo tratado (n=21) com oxitocina, a fertilidade, prolificidade e fecundidade foram, respectivamente, 38,1 %, 175,0 % e 66,67 %. No grupo não tratado (n=13) os parâmetros correspondentes foram 46,15 %, 216,67 % e 100 %, não havendo diferenças significativas entre grupos (P > 0,05). Globalmente (n=34) a fertilidade, prolificidade e fecundidade foram respectivamente 41,18 %, 192,86 % e 79,41 %.
Neste ensaio, a administração de oxitocina por via intracervical previamente à IA não afectou significativamente os parâmetros reprodutivos avaliados.

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Theriogenology, 53(1):416, 2000
EFFECT OF PROSTAGLANDINS ON BOVINE SPERM CAPACITATION AND FERTILISATION IN VITRO.

M.C. Baptista, C.C. Marques, R.M. Pereira, M.I.Vasques, A.E.M. Horta.
Departamento de Fisiologia e Reprodução Animal, EZN-INIA
2000 Vale de Santarem, Portugal

Abstract

Prostaglandins (PG) have been reported to be involved in all stages of sperm maturation, from spermatogenesis to the acrosomal reaction. They may also stimulate or inhibit sperm motility. Previous studies dealing with the role of prostaglandins on in vitro fertilisation of bovine oocytes for embryo production, were performed after the process of sperm capacitation being already initiated. The aim of this study was to evaluate the role of prostaglandins during swim-up and fertilisation procedures. In experiment I (9 trials), the following treatments were added to the swim-up medium: Control; Indomethacin (Indo, 2.8 x 10-5 M); Indo+PGF2alpha (1.4 x 10-7 M); Indo+PGE1 (1.4 x 10-7 M). The same treatments were added to the fertilisation medium (TALP + heparin + PHE), but PGF2alpha and PGE1 run together with control and Indo treatments in experiments II (10 trials) and III (9 trials), respectively. Bovine thawed semen was processed by swim-up in calcium free TALP medium with caffein for 1 h. A final sperm concentration of 1x106 spz/mL was used for insemination. After 22 h of incubation, COC were transferred to an embryo co-culture system using granulosa cells (TCM 199 + 10% oestrous superovulated cow serum). Embryos were evaluated for cleavage 48 h after insemination.

Table 1. Cleavage rates after different prostaglandin treatments and experiments.
Treatments Matured oocytes (n) Cleavage rate (%)
Experiment I (Swim-up):
1. Control 417 54.0a
2. Indomethacin 438 45.0b
3. Indo+PGF2alpha 440 38.4c
4. Indo+PGE1 432 51.2a
Experiment II (Fertilisation):
1. Control 323 67.8a
2. Indomethacin 302 53.0b
3. Indo+PGF2alpha 289 56.4b
Experiment III (Fertilisation):
1. Control 318 55.3a
2. Indomethacin 321 47.7b
3. Indo+PGE1 320 51.6ab
a-cDifferent superscrips are significantly different (P< 0.05, except for treatments 2 vs 4 from Experiment I, where P = 0.068).

Results show that prostaglandin synthesis inhibition significantly reduced fertilisation rates in all experiments. PGF2alpha showed an even greater reduction in fertilisation rates than indomethacin when added to swim-up medium. PGE1 was able to completely reverse the negative effect of indomethacin in swim-up medium. This reversal effect of PGE1 was only partially achieved when treatments were added to fertilisation medium. These results confirm that also in bovine, prostaglandins play an essential role during the capacitation and fertilisation mechanisms and further suggest that a very same prostaglandin may play different roles on each of these mechanisms with very important consequences to in vitro fertilisation rates.



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Proceedings of the 14th Scientific Meeting AETE, 11-12 Sep, Venice-Italy, p.208, 1998
Effect of transfer of frozen IVP cattle embryos on pregnancy maintenance of inseminated recipients.

Lopes da Costa, L.F., Quaresma, M., *Horta, A.E.M., Robalo Silva, J.

CIISA/Faculdade de Medicina Veterinária, Rua Gomes Freire 1100 Lisboa, Portugal
*Departamento de Fisiologia e Reprodução Animal, EZN-INIA
2000 Vale de Santarem, Portugal

Abstract

Transfer of in vivo or in vitro produced (IVP) embryos to previously inseminated recipient cows is reported to result in high pregnancy and twinning rates. However , survival of IVP transferred embryos is greatly reduced after freezing. Data on survival rate of IVP frozen cattle embryos and their effect on pregnancy maintenance of previously inseminated recipient cows are presented in this paper. Beef suckler cows were treated for estrus synchronization with the Crestar@ (Intervet) method and a 500 UI eCG (Intergonan, Intervet) injection on the day of implant removal (left in situ 8-10 days) and then artificially inseminated. On D7 (D0 = estrus) cows were allocated at random to a control group (AI) or received an IVP frozen embryo in the uterine horn contralateral to the corpus luteum (AI+ET group ). This was done in 4 replicates. In replicates 3 and 4, half of the cows of the AI+ET group were P4 supplemented with a norgestomet implant between D7-21 (AI+ETsup group). Embryos were produced from in vitro matured, fertilized and co-cultured (granulosa cells) oocytes obtained from post-mortem recovered ovaries of dairy heifers and cows. Grade 1 blastocysts were frozen in 1.5 M ethylene-glycol plus 0.1 M sucrose in PBS+FCS, thawed in a 25°C water-bath, followed by direct transfer to recipients. Progesterone (P4) was measured in plasma samples on D0, D7 and D21. Pregnancy was diagnosed on D21 by plasma P4 and on D60 by echography. For data analysis (chi-square test) only cows responding to synchronization (showing estrus and P4D0 <= 0.5 ng/ml; P4D7 >= 1.0 ng/ml and a palpable corpus luteum) were considered. Data of the 4 replicates were analyzed together .
As shown in the table below. the number of females assumed pregnant on D21 (P4D0 <= 0.5 ng/m1, P4D7 >= 1.0 ng/ml and P4D21 > 2.0 ng/ml) was higher in the AI+ET groups than in the control group, but the difference was not significant (P > 0.05). On D60 pregnancy rates were not different, but calving rate of the AI+ET group was lower than in the other groups due to higher pregnancy losses (P < 0.01 ), specially between D60 and calving. Fourteen of the 17 IVP calves born were co-twins with AI calves. In the AI+ET group 60% of the losses were abortion of twins, which suggests that pregnancy maintenance of embryos resulting from AI may be negatively affected by the death of IVP frozen embryos.

Table. Effect of transfer of frozen IVP cattle embryos on pregnancy maintenance of inseminated recipients. Data = n (% ).

Group

n

Pregnant

Calving

Pregnancy

IVP Embryo

 

 

D21

D60

 

losses

survival

AI

92

64 (69.6)

57 (62.0)

54 (58.7)

10 (15.6) a

-

AI+ET

79

67 (84.8)

48 (60.8)

33 (41.8)

34 (50.7) b

11 (13.9)

AI+ETsup

34

29 (85.3)

19 (55.9)

19 (55.9)

10 (34.5) ab

6 (17.6)