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Proceedings of 1st Iberian Congress on Animal Reproduction, 3-6 July 1997, Estoril, Vol. II, pp. 155-164
Rev Port Cienc Veter, Vol 93(525): 25-30. (1998)
LUTEOTROPHIC EFFECT OF BOVINE EMBRYOS AND DIFFERENT SERA SUPPLEMENTATION ON GRANULOSA CELL MONOLAYERS IN VITRO *.

Vasques, M.I., Marques, C.C., Pereira, R.M., Baptista, M.C., Horta, A.E.M.

Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional - INIA,
Vale de Santarém, Apartado 17, 2000 Vale de Santarém, Portugal

Abstract:

Progesterone (P4) concentrations were measured in the culture medium of granulosa cell monolayers with embryos (15 repetitions; 892 in vitro fertilised embryos - IVF), or without co-cultured embryos (18 repetitions) and supplemented with oestrous cow serum after superovulation (SOCS). P4 was radioimmunoassayed on 50 ul media pools reconstituted from individual culture drops by the time of the medium refreshments. The 24h old IVF embryos were joined to granulosa cells with 48h of culture. The same protocol was implemented with culture media supplemented with oestrus cow serum after spontaneous heat (OCS) but in a small number of repetitions (n=5).
In the SOCS group, progesterone concentrations in the medium without embryos rose significantly from day zero to day 4 of culture, and from then to day 14 there was only a slight consistent increase. In the group containing embryos, progesterone levels rose significantly from day 0 to day 4, then the concentrations stabilised until day 9, there was a second significant rise in day 11 with no further increase onwards. The average P4 concentrations in the media containing embryos on days 4, 7, 9, 11, and 14 of culture were significantly higher than their homologous in the group without embryos, the difference being 21.7, 19.6, 18.7, 35.2 and 35.1 ng/ml respectively (P< 0.01). Each of the embryos joined to the co-culture media induced a marked luteinizing effect on granulosa cells which was confirmed by a rise in P4 secretion, positive and significantly dependent on the age of the embryo (Y =-0.098+0.042.X, r=0.975; P< 0.01). Each embryo provoked a P4 rise equivalent to 0.02, 0.15, 0.28 and 0.34 ng/ml for 2.5, 7, 9, and 10 days old embryos, respectively. In the OCS group only a non biphasic pattern on P4 synthesis under the presence of embryos was observed. Progesterone synthesis by granulosa cells co-incubated with embryos was significantly higher in SOCS than OCS group on days 2, 9, 11, and 14 of culture.
Results above show that granulosa cells cultured in vitro become luteinized, probably due to the stimulus of LH and other luteotrophic agents that are present in oestrous cow serum added to the culture medium. This luteinization process is further stimulated by the presence of co-cultured IVF embryos. This embryo-mediated luteinizing effect on granulosa cell monolayers is highly correlated with the age of the embryo, the higher stimulus on progesterone production being observed when expanded and hatched blastocysts are present. Oestrous serum from superovulated cows significantly increased the embryo-mediated effect on progesterone output when compared to serum from cows with spontaneous heat.

* PFIZER Award / 1997


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Proceedings do 1º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, 3-6 Julho 1997, Estoril, Vol. II, pp. 155-164
Rev Port Cienc Veter, Vol 93(525): 25-30. (1998)
EFEITO LUTEOTRÓFICO DE EMBRIÕES BOVINOS E DE DIFERENTES TIPOS DE SOROS SOBRE CÉLULAS DA GRANULOSA CULTIVADAS IN VITRO *.

Vasques, M.I., Marques, C.C., Pereira, R.M., Baptista, M.C., Horta, A.E.M.

Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional - INIA,
Vale de Santarém, Apartado 17, 2000 Vale de Santarém

Sumário:

Foram doseadas as concentrações médias de progesterona (P4) contidas no meio de cultura de células da granulosa em monocamada com embriões (15 repetições; 892 embriões fertilizados in vitro - FIV) ou sem embriões (18 repetições) e suplementado com soro de vaca em cio após superovulação (SOCS). A progesterona foi doseada por RIA de pools de 50 ul de meio de cultura constituídos a partir de cada gota no momento do refrescamento destas ao longo da cultura. Os embriões foram introduzidos na co-cultura às 24 horas após a FIV, altura em que as células da granulosa já se encontravam em cultura há dois dias. O mesmo protocolo foi executado com meios suplementados com soro de vaca em cio natural (OCS) e os seus efeitos comparados com o grupo SOCS.
Nos meios suplementados com SOCS, a concentração de P4 durante a cultura de monocamadas de células da granulosa sem embriões aumentou acentuadamente desde o dia zero até ao 4º dia e de forma menos acentuada até ao dia 14. No grupo da co-cultura (células da granulosa + embriões) verificou-se um aumento significativo até ao dia 4, uma estabilização até ao dia 9 e de novo um aumento acentuado e significativo no dia 11, mantendo-se estável até ao 14º dia. No grupo da co-cultura, as concentrações médias de P4 nos dias 4, 7, 9, 11 e 14 de cultura foram significativamente superiores às suas homólogas do grupo sem embriões em 21,7, 19,6, 18,7, 35,2 e 35,1 ng/ml, respectivamente (P< 0,01). Cada embrião colocado no meio de cultura provocou um acentuado efeito luteinizante sobre as células da granulosa, que se traduziu por um aumento da síntese de P4 significativamente dependente da idade dos embriões (Y =-0,098+0,042.X, r=0,975; P< 0,01). O efeito estimulante de cada embrião na produção de P4 traduziu-se em 0,02, 0,15, 0,28 e 0,34 ng/ml respectivamente aos 2,5, 7, 9 e 10 dias de idade. O efeito estimulante dos embriões sobre a produção de P4 quando o meio foi suplementado com OCS, não apresentou a característica bifásica observada no grupo SOCS. O estímulo à síntese de P4 pelos embriões foi significativamente superior no grupo suplementado com SOCS ao 2º, 9º, 11º e 14º dias de cultura.
Os resultados apresentados evidenciam que as células da granulosa, quando colocadas em cultura in vitro sofrem um processo de luteinização provavelmente devido ao estímulo da LH e outros factores luteinizantes contidos no soro de vaca em cio que é adicionado ao meio. Por outro lado, este processo de luteinização é potencializado quando se juntam embriões fertilizados em co-cultura. O estímulo luteinizante dos embriões sobre as células da granulosa acentua-se com o estadio de desenvolvimento embrionário, verificando-se o maior estímulo quando os embriões se encontram nas fases de blastocito expandido e de extrusão. Este efeito estimulante dos embriões na produção de P4 é significativamente superior nos meios suplementados com SOCS.

Trabalho parcialmente financiado pelo projecto PRAXIS/3.2/AGR/01/94

* Prémio PFIZER / 1997



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Proceedings of 1st Iberian Congress on Animal Reproduction, 3-6 July 1997, Estoril, Vol. II, pp. 150-154
INFLUENCE OF MECHANICAL AGITATION AND HYALURONIDASE PERFORMED ON BOVINE OOCYTES AFTER IN VITRO FERTILIZATION ON EMBRYO CLEAVAGE AND DEVELOPMENT.

Pereira, R.M., Marques, C.C., Vasques, M.I., Baptista, M.C. e Horta, A.E.M.

Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional - INIA,
Vale de Santarém, Apartado 17, 2000 Vale de Santarém

Summary:

In some studies, it is advised to remove the cumulus cells surrounding bovine oocytes after in vitro fertilisation (IVF). To accomplish that we compared the use of mechanical agitation by vortex (V) with vortex associated with a 0.1% solution of hyaluronidase (V+Hya). Treatments were performed 22h after in vitro insemination, immediately before the transfer of the inseminated oocytes to granulosa monolayers. In experiment I a control group with none of the treatments above (T1, 379 oocytes) was compared with treatment V (n=345). In experiment II a control group (T2, n=444) was compared with treatment V+Hya (n=440). The effect of treatments above on cleavage rates, day 8 (D8) and hatched embryos production, and embryo quality was evaluated.
Cleavage rate, assessed 24 hours after oocyte transfer to monolayers, was not affected by V treatment (T1 = 79.4% vs. V = 74.8 %, P>0.05) but was significantly reduced by V+Hia treatment (T2 = 83.8% vs. V+Hya = 78.2%, P< 0.05). None of the above treatments influenced the percentage of D8 and hatched embryos. However, the percentage of grade 2 embryos with 8 days old (good quality embryos) was significantly decreased by V+Hia treatment (33.7% vs. 22.11%; P< 0.067).
Results above suggest that oocyte cleavage rate and D8 embryo quality are impaired by mechanical agitation of oocytes with vortex plus hyaluronidase but not with vortex alone.



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Proceedings do 1º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, 3-6 Julho 1997, Estoril, Vol. II, pp. 150-154
INFLUÊNCIA DA AGITAÇÃO MECÂNICA E DA HIALURONIDASE NO TRATAMENTO DE OÓCITOS BOVINOS APÓS A INSEMINAÇÃO IN VITRO SOBRE A CLIVAGEM E PRODUÇÃO DE EMBRIÕES.

Pereira, R.M., Marques, C.C., Vasques, M.I., Baptista, M.C., Horta, A.E.M.

Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional - INIA,
Vale de Santarém, Apartado 17, 2000 Vale de Santarém

Sumário

Depois da fertilização in vitro de oócitos bovinos, em determinadas situações é necessário proceder à remoção das células do cumulus que os rodeiam. Comparou-se a acção da agitação mecânica utilizando somente o vortex (V) e a agitação mecânica com vortex associada a uma solução a 0.1% de hialuronidase (V+Hia), na remoção das células do cumulus de oócitos bovinos, maturados e fertilizados in vitro, e na produção de embriões em co-cultura com monocamadas de células da granulosa. A transferência para as monocamadas, essencial ao desenvolvimento embrionário, efectuou-se 22h depois da inseminação, imediatamente após terem sido submetidos aos seguintes tramentos: Exp. I - testemunha, sem tratamento (T1, n=379) vs. V (n=345) e, Exp. II - testemunha (T2, n=444) vs. V+Hia (n=440).
A taxa de clivagem, avaliada 24 horas após a transferência dos oócitos inseminados para as monocamadas, foi significativamente afectada pelo tratamento V+Hia (T1 = 79,41% vs. V = 74,78 %, p>0.05; T2 = 83,78% vs. V+Hia = 78,18%, P< 0.05). A taxa de embriões em D8 e extrusados em D12 e D13, não foi significativamente afectada por nenhum dos tratamentos. No entanto, a taxa de embriões em D8 com boa qualidade (grau 2) foi significativamente inferior após o tratamento com V+Hia (33,67% vs. 22,11%, P=0,067).
Estes resultados sugerem que a associação da agitação mecânica (vortex) com a hialuronidase no tratamento dos oócitos compromete a clivagem e a qualidade dos embriões obtidos.

Trabalho parcialmente financiado pelo projecto PRAXIS/3.2/AGR/01/94



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Proceedings of 1st Iberian Congress on Animal Reproduction, 3-6 July 1997, Estoril, Vol. II, pp. 142-149
ROLE OF PROSTAGLANDINS ON BOVINE OOCYTE MATURATION IN VITRO

Marques, C.C., Pereira, R.M., Vasques, M.I., Baptista, M.C., Horta, A.E.M.

Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional - INIA,
Vale de Santarém, Apartado 17, 2000 Vale de Santarém, Portugal

Summary:

The effect of prostaglandin E2 (PGE2, 1.4 x 10-8 M) and the inhibition of prostaglandin synthesis by a cyclooxygenase inhibitor (indomethacin, 28 mM) on in vitro bovine oocyte maturation was studied (total oocytes=2003). Drugs were added to the oocyte maturation medium. Oocyte maturation rate was determined 24 hours after culture by morphologic observation (Experiment 1, on 1488 oocytes: Control=469, PGE2=521 and indomethacin=507, on 11 sessions).and confirmed in a smaller sample by nuclear staining with aceto-lacmoid of previously fixed oocytes (Experiment 2, with 515 oocytes: Control=164, PGE2=179 and indomethacin=172, on 5 sessions). Matured oocytes from Experiment 1 were fertilised in vitro and co-cultured with granulosa cell monolayers until the hatching stage.
In experiment 1, both PGE2 and indomethacin treatments significantly increased the oocyte maturation rate, when compared with control (90% and 86.1% vs. 80.1%; P< 0.0002 and P< 0.018, respectively). Differences between PGE2 and indomethacin treatments are significant at a P level < 0.097. These results were confirmed in Experiment 2 where oocyte maturation rates were significantly higher in PGE2 and indomethacin (87.4% and 82.7% vs. 72.97%, respectively; P< 0.02). The PGE2 treatment kept the tendency to be higher than indomethacin although at a less degree of significance. None of the parameters related with cleavage and embryo development showed any significant differences among groups.
Results above suggest that during bovine oocyte maturation in vitro some of the prostaglandins normally synthesised impair meiosis resumption. PGE2 seems to stimulate this mechanism either by antagonising other arachidonate metabolites or directly enhancing the meiosis competence of treated oocytes.



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Proceedings do 1º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, 3-6 Julho 1997, Estoril, Vol. II, pp. 142-149
EFEITO DAS PROSTAGLANDINAS SOBRE A MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS.

Marques, C.M., Pereira, R.M., Vasques, M.I., Baptista, M.C., Horta, A.E.M.

Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional - INIA,
Vale de Santarém, Apartado 17, 2000 Vale de Santarém, Portugal


Resumo:

Foi determinado o efeito da prostaglandina E2 (1,4 x 10-8 M ) e da inibição da síntese das prostaglandinas (indometacina; 28 mM) sobre a taxa de maturação in vitro de oócitos de bovino (n=2003). As drogas foram adicionadas ao meio de maturação dos oocitos. A taxa de maturação (24 horas após a cultura) foi avaliada por observação morfológica a pequena ampliação (Experiência 1, n=1488 oócitos: testemunha=469 em 10 sessões, PGE2=512 e indometacina=507 em 11 sessões cada) e confirmada numa pequena amostragem por observação cromossómica através de coloração nuclear com aceto-lacmoid dos oocitos previamente fixados (Experiência 2, n=515 oócitos: testemunha=164, PGE2=179 e indometacina=172 em 5 sessões cada). Os oócitos maturados foram fertilizados in vitro imediatamente após o processo de maturação seguindo o seu desenvolvimento em co-cultura com células da granulosa até à fase de embriões extrusados. Os resultados da taxa de fertilização e produção de embriões em diferentes fases de crescimento foram comparados entre os tratamentos. instituídos no meio de maturação.
Na Experiência 1, os oócitos tratados com PGE2 e indometacina apresentaram uma taxa de maturação significativamente superior ao grupo testemunha (90% e 86,1% vs. 80,1%; P< 0,0002 e P< 0,018, respectivamente). Pelo teste de comparações múltiplas (LSD) verifica-se que existe uma forte tendência para as taxas de maturação no grupo PGE2 serem superiores às do grupo indometacina (P< 0.097). Estes resultados são confirmados na Experiência 2 pela pequena amostragem submetida a coloração nuclear. Este método confirmou que a taxa de maturação obtida no grupo testemuna é significativamente inferior à dos grupos tratados com PGE2 e indometacina (72,97% vs. 87,41% e 82,7%, respectivamente; P< 0,02) O grupo tratado com PGE2 manteve a tendência para ser superior ao da indometacina, embora de forma menos expressiva do que a evidenciada pela avaliação morfológica. Nenhum dos parâmetros relacionados com a clivagem e desenvolvimento embrionário mostrou diferenças significativas entre os tratamentos efectuados.
Os resultados sugerem que durante o processo de maturação de oócitos bovinos in vitro são sintetizadas prostaglandinas que inibem a meiose. Por outro lado é sugerido que a PGE2 estimula este mecanismo, quer antagonizando a acção de outros metabolitos do ácido araquidónico quer estimulando directamente a competência meiótica dos oócitos tratados.

Trabalho financiado pelos projectos 221/96/PIDDAC e PRAXIS/3.2/AGR/01/94



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Proceedings of 1st Iberian Congress on Animal Reproduction, 3-6 July 1997, Estoril, Vol. II, pp. 293-298
THE EFFECT OF BLOCKING PROGESTERONE RECEPTORS ON THE MECHANISM OF OVULATION IN SUPEROVULATED EWES

Cavaco Gonçalves, S.*, Horta, A.E.M.**

*Direcção Geral de Veterinária, Lisboa
** Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional - INIA,
Vale de Santarém, Apartado 17, 2000 Vale de Santarém

Summary:

The aim of this work was to check the effect of blocking progesterone receptors on the mechanism of ovulation, in superovulated ewes. The oestrous cycle of 10 ewes was synchronised with vaginal sponges containing 40 mg of fluorgestone acetate (FGA, "Chronogest®", Intervet) during 9 days. The day before before sponge withdrawal, all animals received 7.5 mg of PGF2 alpha and 1500 u.i. of PMSG, intramuscularly. The control group received only the treatment above (C, n=5). To the remaining animals (T, n=5) it was further administered a progesterone antagonist (onapristone, ZK 98.299, Schering AG) every 12 h from sponge withdrawal to 24 h after the onset of oestrus (1 mg Kg -1 b.w., intravenously). In both groups, peripheral concentrations of progesterone and LH were respectively measured by radioimmunoassay and ELISA during the periovulatory period.
All animals in both groups showed oestrous behaviour, LH surge and ovulated. Animals receiving the progesterone antagonist started oestrous behaviour significantly sooner than controls (24 h vs. 31.2 h, respectively, P< 0.05). Intervals from sponge withdrawal and onset of oestrus to LH surge were not different between groups. The average number of ovulations per animal was not significantly different between groups (5.4 vs. 10, respectively for groups T and C; P>0.05). Peripheral progesterone concentrations were found basal in both groups during the studied period.
Progesterone blockade during the follicular phase of the oestrous cycle in the ewe did not prevent ovulations to occur, suggesting a non essential role of the intrafollicular progesterone on the mechanism of ovulation in this species. Oestrous behaviour on the antiprogesterone treated animals occurred significantly sooner and in a more synchronised way than in controls, suggesting that intrafollicular progesterone may interfere locally delaying follicular growth.



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Proceedings do 1º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, 3-6 Julho 1997, Estoril, Vol. II, pp. 293-298
EFEITO DO BLOQUEIO DOS RECEPTORES DA PROGESTERONA SOBRE O MECANISMO DA OVULAÇÃO EM OVELHAS SUPEROVULADAS

Cavaco Gonçalves, S.*, Horta, A.E.M.**

*Direcção Geral de Veterinária, Lisboa
** Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional - INIA,
Vale de Santarém, Apartado 17, 2000 Vale de Santarém

Sumário:

Com este trabalho pretendeu-se verificar o efeito do bloqueio dos receptores à progesterona sobre o mecanismo de ovulação em ovelhas superovuladas. O ciclo de 10 ovelhas foi sincronizado com esponjas vaginais impregnadas com 40 mg de acetato de fluorgestona (FGA, "Chronogest®", Intervet) durante 9 dias. Vinte e quatro horas antes da remoção das esponjas administraram-se por via i.m. 7,5 mg de PGF2a e 1500 u.i. de PMSG. O grupo placebo (P; n=5) apenas recebeu o tratamento descrito. Aos restantes animais (T; n=5) administrou-se o antagonista da progesterona ZK 98.299, por via endovenosa lenta (1 mg Kg -1 p.v.) de 12 em 12 horas, desde a remoção das esponjas até 24 h após o início do cio, de modo a exercer o seu efeito durante o período das ovulações. Em ambos os grupos doseou-se a progesterona e a LH por radioimunoensaio e ELISA, respectivamente, durante o período péri-ovulatório.
Todos os animais em ambos os grupos mostraram cio, pico de LH e ovulações. Os animais do grupo T iniciaram o cio significativamente mais cedo que os do grupo placebo (24 h vs. 31,2 h, respectivamente, P< 0,05). Os intervalos entre a remoção das esponjas e o pico de LH e entre o cio e o pico de LH, não foram diferentes entre os grupos estudados. O número de ovulações por animal, embora apresentando um valor absoluto médio mais baixo no grupo T, não apresentou diferenças significativas entre os grupos (5,4 vs 10, P>0,05). As concentrações periféricas de progesterona mantiveram-se nos valores basais em ambos os grupos, durante o período estudado.
O bloqueio da acção da progesterona durante a fase folicular não inibiu a ovulação em ovelhas superovuladas, sugerindo que a acção desta hormona ao nível do folículo não é essencial ao mecanismo da ovulação. O cio dos animais tratados com o antagonista manifestou-se mais cedo e de forma mais sincronizada do que no grupo placebo, sugerindo que a acção progesterona intrafolicular (não detectada no sangue periférico) parece interferir localmente atrasando o crescimento folicular.

Trabalho parcialmente financiado pelo projecto PRAXIS/3.2/AGR/01/94



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Proceedings of 1st Iberian Congress on Animal Reproduction, 3-6 July 1997, Estoril, Vol. II, pp. 136-141
EFFECT OF COOLING DONOR OVARIES ON IN VITRO BOVINE EMBRYO PRODUCTION AND CULTURE OF GRANULOSA CELL MONOLAYERS.

Marques, C.C., Pereira, R.M., Vasques, M.I., Baptista, M.C., Horta, A.E.M.

Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional - INIA,
Vale de Santarém, Apartado 17, 2000 Vale de Santarém, Portugal

Summary:

Donor ovaries for granulosa cell and oocyte in vitro cultures, collected at slaughter house were conditioned at 4ºC and 37ºC. The effects of conditioning temperatures of donor ovaries on granulosa cell viability at the onset of in vitro culture, oocyte maturation, in vitro fertilisation and embryo development as well as on D8 embryo quality, were evaluated.
The percentage of viable granulosa cells at the beginning of culture was significantly higher when donor ovaries were conditioned at 4ºC (29.7% vs. 24.6%, P< 0.01). On the other hand, cooled ovaries provoked a significant decrease on oocyte maturation (56.8% vs. 76.4%, P<0.0002) and tended to decrease cleavage rate (77.4% vs. 83.1%, P< 0.10). The decrease on oocyte maturation formerly checked by observing fresh oocytes, was confirmed by nuclear staining of previously fixed oocytes (56.3% vs. 73.6%, P< 0.005). The conditioning temperature of donor ovaries did not influence either the rates of D8 or hatched embryos. Quality of transferable embryos (D8) was impaired by cooling, the proportion of good quality grade 2 embryos being significantly decreased (2.7% vs. 27.2%, P< 0.001) and that of poor quality grade 4 embryos being increased (42% vs. 23.3%, P< 0.003).
Results above show that cooling bovine donor ovaries at 4ºC before processing, significantly improve the viability of granulosa cells to be used in monolayers co-incubated in vitro with embryos. On the other hand, cooled donor ovaries significantly decrease the meiotic competence of collected oocytes and the quality of transferable embryos with 8 days old.



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Proceedings do 1º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, 3-6 Julho 1997, Estoril, Vol. II, pp. 136-141
INFLUÊNCIA DA REFRIGERAÇÃO DE OVÁRIOS DADORES NA PRODUÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS E CULTURA DE CÉLULAS DA GRANULOSA IN VITRO

Marques, C.C., Pereira, R.M., Vasques, M.I., Baptista, M.C., Horta, A.E.M.

Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional - INIA,
Vale de Santarém, Apartado 17, 2000 Vale de Santarém, Portugal

Sumário:

Ovários bovinos colhidos em matadouro e utilizados como dadores de células da granulosa e oócitos para a produção de embriões in vitro foram acondicionados a 4ºC e 37ºC. Estudou-se o efeito da temperatura de acondicionamento quer sobre a viabilidade inicial das células da granulosa a serem utilizadas na co-cultura dos embriões, quer sobre a maturação dos oócitos, as taxas de fertilização e desenvolvimento embrionário in vitro, e a qualidade dos embriões obtidos.
A percentagem de células da granulosa viáveis no início das culturas foi significativamente superior quando as células eram oriundas de ovários refrigerados (29,7% vs. 24,6%, P< 0,01). Por outro lado, o acondicionamento por refrigeração diminuiu significativamente a taxa de maturação oocitária (56,8% vs. 76,4%, P< 0,0002), e só tendencialmente se verificou uma diminuição da taxa de fertilização neste grupo (77,4 vs. 83,1, P< 0,10). A diminuição da taxa de maturação anteriormente avaliada a fresco, foi confirmada numa amostragem através de coloração nuclear (56,3% vs. 73,6%, P< 0,005). A temperatura de acondicionamento dos ovários não influenciou a taxa de produção de embriões com 8 dias de idade (D8) nem a percentagem de embriões extrusados. A qualidade dos embriões D8 foi significativamente afectada pelo processo de refrigeração dos ovários, tendo-se observado neste grupo uma diminuição significativa na proporção dos embriões de boa qualidade (grau 2: 7,2% vs. 27,2%, P< 0,001) e um aumento relativo dos de má qualidade (grau 4: 42% vs. 23,3%, P< 0,003).
Os resultados apresentados mostram que a viabilidade das células da granulosa cultivadas in vitro é favoravelmente influenciada pelo acondicionamento dos ovários dadores a 4ºC. Por outro lado, a refrigeração dos ovários a 4ºC, diminui significativamente a competência meiótica dos oócitos e a qualidade dos embriões obtidos ao 8º dia (embriões transferíveis).

Trabalho parcialmente financiado pelo projecto PRAXIS/3.2/AGR/01/94



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Proceedings of 1st Iberian Congress on Animal Reproduction, 3-6 July 1997, Estoril, Vol. II, pp. 128-135
EFFECT OF OESTROUS COW SERUM FROM SUPEROVULATED ANIMALS ON IN VITRO BOVINE EMBRYO PRODUCTION AND ON PROGESTERONE SYNTHESIS OF GRANULOSA CELL MONOLAYERS.

Pereira, R.M., Vasques, M.I., Marques, C.C., Baptista, M.C., Horta, A.E.M.

Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional - INIA,
Vale de Santarém, Apartado 17, 2000 Vale de Santarém

Summary:

The effects of two types of oestrous cow serum added to in vitro culture media (OCS - natural oestrus; SOCS - superovulated oestrus) on embryo production co-incubated with granulosa cell monolayers, were studied. Both sera were collected 24 hours after the onset of heat. The following parameters were evaluated and compared: oocyte maturation, oocyte cleavage rate after IVF, percentage of D8 and hatched embryos, embryo development rate between 7th and 9th days of culture, D8 embryo quality (ranging from 1-excellent and 4-poor), and progesterone production by granulosa cell monolayers.
The rates of oocyte maturation, cleaved oocytes, D8 and hatched embryos were not different between OCS and SOCS groups. Within D7 embryos there was significantly more expanded embryos in SOCS than in OCS (54.8% vs. 38.9%, respectively, P< 0.055) and less embryos in the blastocyst stage (9.6% vs. 22.2%, respectively, P< 0.037). Within classes of D8 and D9 embryos there was only a tendency for the proportion of embryos in later stages of development being higher in the SOCS group. At D8, the proportion of grade 1 embryos was significantly higher in SOCS than in OCS group (13.1% vs. 1.4%, respectively, P< 0.007). Concerning progesterone production by granulosa monolayers, the concentration found beyond 4 days of culture was significantly higher in SOCS than in OCS group.
The results above show that the addition of oestrous cow serum from superovulated animals (SOCS) to the culture media, when compared with normal oestrous cow serum (OCS), accelerates the growth rate of in vitro co-cultured embryos and improves the quality of D8 blastocysts. This effect seems to be related to a higher luteinizing effect of SOCS on granulosa cell monolayers, suggesting a direct or mediated effect of luteotrophic substances present in SOCS on a faster embryo growth and better quality of transferable embryos.



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Proceedings do 1º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, 3-6 Julho 1997, Estoril, Vol. II, pp. 128-135
EFEITO DO SORO DE VACAS EM CIO SUPEROVULADAS, SOBRE A PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS E A SÍNTESE DE PROGESTERONA POR MONOCAMADAS DE CÉLULAS DA GRANULOSA.

Pereira, R.M., Vasques, M.I., Marques, C.C., Baptista, M.C., Horta, A.E.M.

Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional - INIA,
Vale de Santarém, Apartado 17, 2000 Vale de Santarém

Sumário:

Comparou-se o efeito do soro sanguíneo de vacas em cio natural (OCS) ou após superovulação (SOCS), quando adicionados aos meios de cultura, sobre a produção de embriões em co-cultura com monocamadas de células da granulosa. Ambos os soros foram colhidos 24 horas após o início do cio. O efeito dos dois tipos de soros utilizados foi comparado relativamente à maturação do oócito, clivagem após a fertilização in vitro, proporção de embriões obtidos ao 8º dia e de embriões extrusados, velocidade de crescimento embrionário entre o 7º e 9º dias de cultura, qualidade dos embriões em D8 (excelente = grau 1; mau = grau 4), e produção de progesterona pelas células da granulosa.
A suplementação com SOCS ou OCS não se traduziu em diferenças significativas quanto às percentagens de maturação oocitária, de fertilização, de embriões obtidos em D8 ou extrusados. Ao 7º dia de cultura, o grupo suplementado com SOCS apresentou significativamente mais embriões em estadio de blastocito expandido (54,8% vs. 38,9%; P< 0,055) e menos em estadio de blastocito (9,6% vs. 22,2%; P< 0,037) do que o grupo suplementado com OCS. Nos dias 8 e 9, manteve-se a tendência para haver uma maior proporção de embriões em estadios mais avançados no grupo suplementado com SOCS. Ao 8º dia de cultura, os embriões suplementados com SOCS mostraram uma qualidade superior do que os do grupo OCS, traduzindo-se por um aumento significativo da taxa de embriões de grau 1 (13,1% vs. 1,4%; P< 0,007). Nas culturas suplementadas com SOCS, houve uma maior produção de progesterona por parte das células da granulosa a partir do 4º dia de cultura.
Os resultados demonstram que o soro sanguíneo de vacas em cio superovuladas (SOCS), quando comparado com o de vacas em cio espontâneo (OCS), acelera o crescimento dos embriões in vitro em co-cultura com células da granulosa e melhora a qualidade dos blastocitos obtidos em D8. Este efeito apareceu associado a um aumento do estímulo luteinizante do SOCS sobre as células da granulosa, sugerindo uma participação directa ou mediada dos factores luteotróficos presentes naquele tipo de soro sobre o crescimento e qualidade dos embriões.

Trabalho parcialmente financiado pelo projecto PRAXIS/3.2/AGR/01/94



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Proceedings of 1st Iberian Congress on Animal Reproduction, 3-6 July 1997, Estoril, Vol. I, pp. 336-339
EFFECT OF CONTRALATERAL IN VIVO OR IN VITRO EMBRYO TRANSFER ON PREGNANCY MAINTENANCE OF PREVIOUSLY INSEMINATED BEEF COWS.

Lopes da Costa, L., Horta, A.E.M.1, Robalo Silva, J.
Faculdade de Medicina Veterinária, 1199 Lisboa Codex
1 Estação Zootécnica Nacional, 2000 Vale de Santarém

Two trials were carried out to evaluate the efficiency of twinning induction and the embryo/fetal survival rate after contralateral transfer of in vitro and in vivo produced embryos to inseminated recipients. All cows were synchronized and fixed time inseminated. In trial 1 cows were inseminated (AI; n=25) or also recieved an in vitro produced embryo (AI+ET; n=23), while in trial 2 cows were inseminated (AI; n=22) or received either an in vivo (AI+ET vivo; n=20) or in vitro (AI+ET vitro; n=31) produced embryo. Embryos were frozen and transfers were direct to the contralateral horn of the CL. Pregnancy was diagnosed on D22 (plasma P4) and D60 (echography). At calving the calves were identified by the phenotype.
In trial 1, pregnancy rates on D22 and D60 were greater for AI than for AI+ET cows (88% vs 69.6%; NS). The calving rate was also greater in the AI group (88% vs 47.8%) but fetal losses between D60 and calving were lower in the AI when compared with AI+ET group (0% vs 31.3%; P< 0.03) More twin pregnancies were induced in AI+ET than in the AI group (8 vs 2; P< 0.05), but a higher fetal loss occurred (5/8 = 63%). Embryo survival rate was low (1/23 = 4.3%).
In trial 2, pregnancy rates for AI+ET vivo, AI+ET vitro, and AI were respectively 90%, 96.8% and 50% on D22 (P=0.1) and 85%, 58.1% and 45.5% on D60 (NS). Sixteen twin pregnancies were were diagnosed in the ET groups, although only 9 cows calved twins (5 in AI+ET vivo and 4 in the AI+ET vitro). The embryo survival rate was 15% (3/20) and 16% (5/31) for the in vivo and in vitro embryos, respectively.
Results from trial 1 suggest that frozen in vitro embryos had a negative influence on AI embryos till D22 and on maintenance of twins after D60. Results from trial 2 suggest that the death of in vivo produced embryos is less deleterious than the in vitro produced embryos in relation to the AI embryo survival. Results from both trials suggest that in the case of cows with twin ovulations ET seems to induce fetal loss or only AI calves are born. Fertlility was similar between synchronized recipients, independently of showing estrous signs or not.


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Proceedings of 1st Iberian Congress on Animal Reproduction, 3-6 July 1997, Estoril, Vol. I, pp. 336-339
EFEITO DA TRANSFERÊNCIA CONTRALATERAL DE UM EMBRIÃO PRODUZIDO IN VIVO OU IN VITRO SOBRE A MANUTENÇÃO DA GESTAÇÃO EM VACAS ALEITANTES INSEMINADAS.

Lopes da Costa, L., Horta, A.E.M.1, Robalo Silva, J.
Faculdade de Medicina Veterinária, 1199 Lisboa Codex
1 Estação Zootécnica Nacional, 2000 Vale de Santarém

Foram realizados dois ensaios para avaliar a eficiência da indução de gestações gemelares e a sobrevivência embrio-fetal após transferência de embriões produzidos in vitro ou in vivo em vacas aleitantes previamente inseminadas. As vacas foram sincronizadas e inseminadas em tempo fixo. No primeiro ensaio, as vacas sincronizadas foram foram distribuídas num grupo IA (n=25) ou IA+TE (transferência contralateral de 1 embrião congelado produzido in vitro; n=23), e no ensaio 2 pelo grupo IA (n=22), IA+TE vivo (n=20) e IA+TE vitro (n=31) (transferência contralateral de um embrião produzido in vivo ou in vitro). O diagnóstico de gestação foi realizado em D22 (P4 plasmática) e D60 (ecografia), sendo os vitelos identificados ao parto pelo fenotipo.
No ensaio 1, a taxa de gestação em D22 e D60 (idênticas) foi maior no grupo IA do que no grupo IA+TE (88% vs 69,6%; NS), bem como a taxa de parição (88% vs 47,8%; NS). No grupo IA verificou-se uma menor mortalidade fetal entre D60 e o parto (0% vs 31,3%; P< 0,03). No grupo IA+TE houve mais gestações gemelares (8 vs 2; P< 0,05), mas uma percentagem elevada destas não chegou a termo (5/8 - 63%). A taxa de sobrevivência dos embriões in vitro foi baixa (1/23 - 4,3%). No ensaio 2, as taxas de gestação D22, D60 e de parição nos grupos IA+TE vivo e IA+TE vitro e IA foram respectivamente 90% vs 96,8% vs 50% (P=0,1; D22), 85% vs 58,1% vs 45,5% (NS; D60) e 60% vs 45,2% vs 31,8% (NS; parição). Nos grupos com TE foram diagnosticadas 16 gestações gemelares, tendo ocorrido somente 9 partos (5 no grupo IA+TE vivo e 4 no grupo IA+TE vitro). A sobrevivência embrionária foi de 3/20 (15%) e de 5/31 (16%) respectivamente para os embriões in vivo e in vitro.
No ensaio 1 os resultados sugerem que a morte do embrião in vitro afectou a manutenção da gestação e a sobrevivência do embrião obtido por IA até ao dia 22 e que após D60 resultou em grandes perdas de gestações gemelares. No ensaio 2 os resultados mostram que a morte do embrião in vivo afecta menos a sobrevivência do embrião de IA, que a morte do embrião in vitro. Nos dois ensaios os resultados sugerem que em fêmeas com 2 ovulações a TE pode induzir a perda da gestação ou os vitelos nascidos são provenientes apenas da IA. A fertilidade foi idêntica em fêmeas mostrando ou não sinais exteriores de cio.


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